本文關(guān)鍵詞：AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞低糖性水腫中的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)在星形膠質(zhì)細(xì)胞低血糖性水腫中所起的作用及其相關(guān)作用機(jī)制。方法:(1)在嚴(yán)重低血糖條件下(0.2m M葡萄糖)檢測原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞系CTX-TNA2細(xì)胞體積的變化情況;(2)檢測原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和CTX-TNA2星形膠質(zhì)細(xì)胞中水通道蛋白4的表達(dá)情況;(3)構(gòu)建帶EGFP標(biāo)簽的野生型AQP4并轉(zhuǎn)染至CTX-TNA2細(xì)胞中,建立表達(dá)AQP4蛋白的細(xì)胞模型,同時(shí)予以低血糖(0.2m M葡萄糖)干預(yù),24小時(shí)后觀察表達(dá)AQP4細(xì)胞體積的變化情況;(4)使用AQP4 Si RNA抑制原代星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的表達(dá),予以上述處理后比較低血糖時(shí)AQP4抑制組和對(duì)照組細(xì)胞體積的變化情況,進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果;(5)構(gòu)建突變型p EGFP-C2-AQP4-M23質(zhì)粒:S111A和S180A,檢測這兩種突變型蛋白在低血糖性細(xì)胞水腫中的作用效果。所收集的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 16.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:(1)在長時(shí)間嚴(yán)重低血糖條件下原代星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞水腫,而CTX TNA細(xì)胞無此現(xiàn)象;(2)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)水通道蛋白4而CTX-TNA2細(xì)胞系不表達(dá);(3)CTX-TNA2細(xì)胞轉(zhuǎn)染AQP4-EGFP質(zhì)粒后24小時(shí)可見綠色熒光蛋白表達(dá),并可被特異性的AQP4抗體所識(shí)別,成功構(gòu)建了AQP4示蹤系統(tǒng);同時(shí),在嚴(yán)重低血糖條件下,過表達(dá)AQP4的CTX-TNA2細(xì)胞與野生型CTX-TNA2細(xì)胞相比細(xì)胞體積明顯變大;(4)抑制原代星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4蛋白的表達(dá)后低血糖條件下細(xì)胞水腫的現(xiàn)象消失;(5)低血糖處理24h后,表達(dá)野生型AQP4和S180A突變AQP4的CTX-TNA2細(xì)胞體積明顯大于對(duì)照組,而表達(dá)S111A型AQP4蛋白的細(xì)胞體積與對(duì)照組無明顯差別。結(jié)論:低血糖性星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的形成過程中需要AQP4的參與,在這一過程中AQP4蛋白的第111位絲氨酸活化起到了關(guān)鍵作用。
【關(guān)鍵詞】：水通道蛋白4 綠色熒光蛋白 低血糖 腦水腫
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.2;R747.9
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 英文縮略語7-13
• 1 前言13-20
• 1.1 低血糖性腦損傷13-17
• 1.1.1 認(rèn)知障礙15
• 1.1.2 癲癇15-16
• 1.1.3 昏迷與腦水腫16-17
• 1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦水腫形成中的作用17-18
• 1.3 研究內(nèi)容及意義18-20
• 2 材料與方法20-47
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞系20
• 2.1.2 載體質(zhì)粒20-21
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑21-22
• 2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)器械和儀器22-23
• 2.2 主要試劑的配置23-25
• 2.3 采用主要軟件25-26
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法26-47
• 2.4.1 分離及培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞26
• 2.4.2 CTX TNA2細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代26-27
• 2.4.3 低血糖時(shí)AST和CTX TNA2星形膠質(zhì)細(xì)胞體積的檢測27-28
• 2.4.4 AQP4在AST和CTX TNA2星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)28-30
• 2.4.5 提取大鼠腦部組織總RNA30-31
• 2.4.6 AQP4目的基因的擴(kuò)增31-35
• 2.4.6.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR反應(yīng)）過程(參考ReverTra Ace qPCR RT Kit說明書)31
• 2.4.6.2 巢式PCR反應(yīng)過程31-34
• 2.4.6.3 PCR反應(yīng)產(chǎn)物的提取與純化34-35
• 2.4.7 pEGFP-C2-AQP4-M23重組質(zhì)粒的構(gòu)建35-36
• 2.4.8 轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞36-37
• 2.4.9 單克隆細(xì)菌菌落的挑取與培養(yǎng)37
• 2.4.10 質(zhì)粒的提取與純化37-38
• 2.4.11 pEGFP-C2-AQP4-M23重組質(zhì)粒的鑒定38-40
• 2.4.11.1 酶切鑒定38-39
• 2.4.11.2 pEGFP-C2-AQP4-M23重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞，檢測AQP4蛋白的表達(dá)情況39-40
• 2.4.12 低血糖時(shí)水通道蛋白4對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞體積的影響40-41
• 2.4.13 抑制水通道蛋白4對(duì)低血糖性星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的影響41-42
• 2.4.13.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的準(zhǔn)備41
• 2.4.13.2 轉(zhuǎn)染AQP4 siRNA抑制原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中AQP4的表達(dá)41-42
• 2.4.13.3 實(shí)驗(yàn)分組和低血糖條件處理42
• 2.4.14 AQP4介導(dǎo)低血糖性星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的作用位點(diǎn)的研究42-45
• 2.4.14.1 構(gòu)建AQP4 M23突變體42-44
• 2.4.14.2 轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞44
• 2.4.14.3 單克隆細(xì)菌菌落的挑取與培養(yǎng)44-45
• 2.4.14.4 S111A-AQP4 M23和S180A-AQP4 M23突變質(zhì)粒的提取與純化45
• 2.4.14.5 S111A-AQP4 M23和S180A-AQP4 M23突變質(zhì)粒的測序鑒定45
• 2.4.15 AQP4蛋白第111位和第180位絲氨酸磷酸化對(duì)低血糖時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫形成的影響45-47
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-68
• 3.1 低血糖時(shí)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞（AST）體積增大而星形膠質(zhì)細(xì)胞系（CTX TNA2）體積未發(fā)生變化47-49
• 3.1.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞低血糖時(shí)的細(xì)胞體積變化48-49
• 3.1.1.1 細(xì)胞形態(tài)變化48
• 3.1.1.2 細(xì)胞體積的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果48-49
• 3.1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞系（CTX TNA2）低血糖時(shí)的細(xì)胞體積變化49
• 3.1.2.1 細(xì)胞形態(tài)變化49
• 3.1.2.2 細(xì)胞體積的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果49
• 3.2 水通道蛋白4在AST細(xì)胞中有明顯表達(dá)，，而在CTX TNA2星形膠質(zhì)細(xì)胞中沒有表達(dá)49-51
• 3.2.1 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果50
• 3.2.2 Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-51
• 3.3 大鼠腦部組織總RNA的濃度與純度檢測51
• 3.4 AQP4目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物的獲得51-52
• 3.5 pEGFP-C2-AQP4-M23重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果初步表明質(zhì)粒構(gòu)建成功52-56
• 3.5.1 酶切鑒定結(jié)果52-54
• 3.5.2 pEGFP-C2-AQP4-M23重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功54-55
• 3.5.3 熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效果顯示表達(dá)質(zhì)粒能夠成功表達(dá)綠熒光蛋白55-56
• 3.5.4 Western Blot結(jié)果顯示重組質(zhì)�？梢猿晒Ρ磉_(dá)AQP4蛋白56
• 3.6 重組質(zhì)粒pEGFP-C2-AQP4-M23在CTX TNA2細(xì)胞中的表達(dá)與定位56-58
• 3.7 轉(zhuǎn)染AQP4的CTX TNA2細(xì)胞在低血糖誘導(dǎo)條件下發(fā)生細(xì)胞水腫58-59
• 3.7.1 LSCM掃描圖像結(jié)果58-59
• 3.7.2 細(xì)胞體積的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析59
• 3.8 抑制原代星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的表達(dá)后低血糖引起星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的現(xiàn)象消失59-64
• 3.8.1 時(shí)間對(duì)AQP4 SiRNA抑制AQP4蛋白表達(dá)效果的影響59-60
• 3.8.2 抑制原代星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的表達(dá)后低血糖時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的體積變化60-64
• 3.8.2.1 低血糖條件下轉(zhuǎn)染AQP4 SiRNA的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)AQP4蛋白情況60-61
• 3.8.2.2 低血糖條件下轉(zhuǎn)染AQP4 SiRNA的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化61-62
• 3.8.2.3 抑制原代星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4蛋白的表達(dá)后，低血糖條件下細(xì)胞體積無明顯變化62-64
• 3.9 AQP4介導(dǎo)低血糖性星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的作用位點(diǎn)為111位絲氨酸64-68
• 3.9.1 S111A AQP4 M23和S180A AQP4 M23突變體的構(gòu)建64-65
• 3.9.2 S111A AQP4 M23和S180A AQP4 M23突變體對(duì)低血糖性星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫形成的影響65-68
• 3.9.2.1 S111A AQP4 M23和S180A AQP4 M23突變體對(duì)低血糖性星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化的影響65-66
• 3.9.2.2 各組細(xì)胞體積的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析66-68
• 4 討論68-73
• 5 結(jié)論與展望73-74
• 6 參考文獻(xiàn)74-78
• 致謝78-79
• 學(xué)術(shù)論文和科研成果目錄79
• 學(xué)術(shù)論文79
• 專利79

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9 周亞蘭;IFN-γ介導(dǎo)T細(xì)胞參與炎性痛慢性化機(jī)制的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

10 鄧子輝;瘦素抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白-43表達(dá)改善腦缺血再灌注損傷的機(jī)制研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

  本文關(guān)鍵詞：AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞低糖性水腫中的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：262810