【摘要】：動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(aneurysmal subarachnoid hemorrhage,aSAH)作為腦血管疾病中的一種,約占所有自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血的85%左右,嚴重威脅的人類的健康。aSAH發(fā)病兇險,病死率高,然而在通常情況下,很難預測顱內(nèi)動脈瘤的生長和破裂,對發(fā)現(xiàn)和治療造成了極大的困擾。近年來,結(jié)合形態(tài)學指標以及血流動力學參數(shù)采用數(shù)值模擬計算流體動力技術(shù)發(fā)現(xiàn)高壁面切應(yīng)力與顱內(nèi)動脈瘤的生長和破裂相關(guān)。血流動力學的變化僅僅是動脈瘤生長和破裂的始動因素,其如何通過“力學改變”進一步演化成為“病理改變”仍為該領(lǐng)域的一個難點。LOX(賴氨酰氧化酶)作為生物體內(nèi)膠原纖維和彈性纖維活化和表達過程中一種重要的催化酶,其異常表達與血管壁破壞性重構(gòu)的病理變化(血管壁細胞外基質(zhì)的降解)密切相關(guān)。我們通過前期預實驗(國家自然基金面上項目81471189)也發(fā)現(xiàn)LOX在動脈瘤患者中有異常表達。因此,我們進一步設(shè)計該實驗來初步探索LOX在血流動力學誘導的顱內(nèi)動脈瘤生成中的作用。目前國內(nèi)外尚未見類似的研究。本研究的主要目的有二:1、細胞水平探索剪切力變化對內(nèi)皮細胞LOX表達的影響;2、動物實驗研究LOX與血流動力學誘導的顱內(nèi)動脈瘤生成之間的關(guān)系。第一部分細胞水平探索剪切力變化對內(nèi)皮細胞LOX表達的影響目的:在細胞水平探索剪切力變化對大鼠內(nèi)皮細胞LOX表達的影響。方法:提取原代SD大鼠顱內(nèi)動脈內(nèi)皮細胞進行培養(yǎng),并將其分成靜止組(0dyn/cm~2)、低剪切力組(12 dyn/cm~2)、正常剪切力組(24 dyn/cm~2)和高剪切力組(36dyn/cm~2),將其放入平行板流動小室內(nèi)通過智能型蠕動泵給予穩(wěn)定的剪切力刺激,培養(yǎng)24 h后測定LOX的mRNA表達情況,LOX蛋白水平的表達情況以及細胞凋亡的情況。結(jié)果:1、LOX蛋白水平的表達在各組間均存在統(tǒng)計學上差異。靜止細胞少量表達,正常剪切力組表達最低(p0.05);低剪切力和高剪切力組有明顯增加(p0.05),且在高剪切力作用下,表達最明顯。2、LOX的mRNA表達在靜止細胞中有少量表達,在正常剪切力作用下表達受一定程度抑制(p0.05)。高剪切力作用下,表達最顯著(p0.05)。3、Cleaved-Caspase 3蛋白的表達水平,以靜止組為參考時,低剪切力和高剪切力組表達均有增加(p0.05),而與正常剪切力組差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。當以高剪切力組為參考時,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。同時可以發(fā)現(xiàn),在高剪切力作用下,Cleaved-Caspase 3蛋白的表達最明顯。結(jié)論:在體外細胞實驗中,LOX蛋白水平的表達在高剪切力作用下時顯著升高;LOX的mRNA表達也顯著升高;同時Cleaved-Caspase 3蛋白表達的增加也最為明顯。提示高剪切力刺激導致LOX表達增加,并促進細胞凋亡。第二部分動物實驗研究LOX與血流動力學誘導的顱內(nèi)動脈瘤生成之間的關(guān)系目的:1、用動物實驗驗證細胞實驗的結(jié)果;2、構(gòu)建干擾LOX表達的腺相關(guān)病毒,特異性干擾LOX的表達;3、研究LOX與血流動力學誘導的顱內(nèi)動脈瘤生成之間的關(guān)系。方法:1、SD大鼠66只,隨機分成空白對照組(n=18)、假手術(shù)組(n=24)、模型組(n=24),建模組通過顯微外科技術(shù)建立血流動力學模型;假手術(shù)組僅做血管探查,不做血管結(jié)扎;空白對照組不做任何處理;3個月后處死制備大鼠顱內(nèi)供血動脈樹脂鑄型標本、免疫組化檢測腦血管LOX蛋白水平的表達情況、Realtime-PCR技術(shù)測定LOX的mRNA表達情況;2、篩選外源有效RNAi載體并進行腺相關(guān)病毒包裝,特異性干擾LOX基因表達;3、再次選取SD大鼠72只,隨機分成模型組(n=24)、干擾組(n=24)和陰性對照組(n=24),所有大鼠均建立血流動力學模型,模型組僅單純建模,干擾組給予尾靜脈注射腺相關(guān)病毒,陰性對照組給予尾靜脈注射陰性對照腺相關(guān)病毒,3個月后處死制備大鼠顱內(nèi)供血動脈樹脂鑄型標本、免疫組化檢測腦血管LOX蛋白水平的表達情況、Realtime-PCR技術(shù)測定LOX的mRNA表達情況。結(jié)果:1、模型組較假手術(shù)組以及空白對照組成瘤率明顯升高,兩者差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),免疫組化提示腦血管LOX蛋白水平的表達明顯增加(p0.05),Realtime-PCR技術(shù)測定LOX的mRNA表達明顯增加(p0.05);2、構(gòu)建腺相關(guān)病毒,表達良好,平均滴度為5.05E+12;3、給予腺相關(guān)病毒特異性干擾LOX表達后,腦血管LOX蛋白水平的表達以及mRNA的表達均有所降低(p0.05)。結(jié)論:在體動物實驗結(jié)果總體變化趨勢與細胞實驗一致。高剪切力的刺激可以導致顱內(nèi)動脈LOX基因表達的增加以及LOX蛋白水平表達的增加,同時導致顱內(nèi)供血動脈瘤樣改變,特異性抑制LOX基因的表達后LOX蛋白水平的表達以及mRNA的表達顯著降低,瘤樣改變可以得到有效的抑制。小結(jié):高剪切力刺激可以導致LOX基因和LOX蛋白水平表達的顯著增加,在細胞實驗和動物實驗中均得到了驗證,體外細胞實驗提示可以導致細胞凋亡,動物在體實驗可以導致大鼠前交通復合體動脈成瘤率增加;特異性抑制LOX的表達后可以使成瘤率降低,對動脈瘤發(fā)生發(fā)展過程起到一定的抑制作用。本研究初步闡明了LOX與血流動力學誘導的顱內(nèi)動脈瘤生成之間的關(guān)系,后期可進行具體機制的研究,從而有望提高我國動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血的防治水平。
【圖文】：

不同剪切力刺激內(nèi)皮細胞實驗過程。 A 為生長在載玻片上大小的蠕動泵；C 為將載玻片放入 Parallel-PlateFlowCham為將整體放入恒溫培養(yǎng)箱中。estern Blot 實驗檢測 LOX 蛋白水平的表達取總蛋白，我們將載玻片無菌取下后用 PBS 沖洗 2 次，用uffer 裂解，用細胞刮刮下細胞轉(zhuǎn)入 EP 管中，將其放在冰上，然后用超聲破碎細胞，參數(shù)為 200 W，共 4 次，每次持s；離心后結(jié)束后，用 BCA 法測定上清液的蛋白濃度。調(diào)整L，-80℃冰箱中。如果是組織的話采用如下方法：在干冰上鐘內(nèi)加入PMSF，采用等量的RIPA裂解液，使PMSF的最終 20mg 組織加入 150-250 uL 裂解液的比列冰浴裂解（因為考，因此我們適當減少了裂解液的用量，從而來保證獲取高濃勻漿，待全裂解后，給予離心（參數(shù)：10000g，時間 5min，下冷藏，備用）；然后根據(jù)目標蛋白的分子量制備不同濃度

原代大鼠顱內(nèi)動脈內(nèi)皮細胞 vWF 免疫熒光鑒定。1：vWF；：倒置顯微鏡下內(nèi)皮細胞生長情況。（×200））采用 western blot 檢測不同剪切力刺激下，L情況部分研究中，根據(jù)既往相關(guān)研究結(jié)果，我們將實驗分為靜止組組和高剪切力組，并設(shè)置剪切力大小分別為 0 dyn/cm2、16dyn/cm2。用智能蠕動泵進行穩(wěn)定的流量控制，在持續(xù)給予集載玻片上的細胞。分別以 Western blotting 檢測各組 LOXern blotting（圖 1-3）實驗結(jié)果如下：LOX 蛋白水平的表達在異。以靜止組為參考，低剪切力和高剪切力組 LOX 蛋白水p＜0.05），正常剪切力組 LOX 蛋白水平的表達有降低的趨正常剪切力與高剪切力和低剪切力組，兩者比較有統(tǒng)計學較高剪切力組和低剪切力組，兩者差異具有統(tǒng)計學意義（p
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743

【參考文獻】

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1 劉勇軍;王萍萍;馬婕;歐陽彬;陳娟;管向東;;改良大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)技術(shù)及細胞鑒定[J];中華損傷與修復雜志(電子版);2014年01期

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3 徐瑾瑜;鄧本強;方亦斌;于瀛;程吉勇;王奎重;黃清海;劉建民;;置入虛擬及真實血流導向裝置后兔動脈瘤模型血流動力學的數(shù)值模擬研究[J];中國腦血管病雜志;2013年10期

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1 于瀛;鈣離子激活鉀通道KCa3.1在血流動力學誘導的顱內(nèi)動脈瘤生成機制中的作用研究[D];第二軍醫(yī)大學;2015年

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本文編號：2617887