【摘要】：研究背景和目的神經病理性痛是最常見的慢性痛之一,主要由神經損傷或炎癥引起,其顯著特點為損傷愈合后疼痛癥狀依然存在,且痛感強烈、頑固,給患者造成了極大的痛苦,目前其確切機制仍不清楚。核蛋白聚ADP-核糖基化(Poly(ADP-ribose)ation,PAR)是聚ADP-核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)激活后,利用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)提供的ADP-核糖,催化其與相關核蛋白結合,形成多聚ADP-核糖基化核蛋白,也被認為是表觀遺傳學的一種形式。研究發(fā)現PARP-1激活通過促進炎癥相關的基因表達在炎性疾病的發(fā)生過程發(fā)揮重要作用。最近研究證明PARP-1催化的核蛋白聚ADP-核糖化通過調控基因轉錄參與腦學習與記憶的長時程突觸可塑性。周圍神經損傷或炎癥誘導的脊髓水平突觸傳遞的可塑性,被認為是病理性痛形成和維持過程中樞敏感化的基礎,但迄今PARP-1在神經病理性痛中的作用及機制仍無系統(tǒng)的研究和報道。本實驗采用大鼠腰5脊神經結扎(Lumbar 5 Spinal Nerve Ligation,L5 SNL)疼痛模型,結合痛行為學實驗和Western blot、RT-PCR和qPCR等分子生物學技術,觀察核酶PARP-1在L5 SNL引起神經病理性痛中的作用以及PARP-1激活調控神經病理性痛的機制。其結果將為進一步闡明神經病理性痛的機制提供新的理論上的依據,同時也可能為臨床病理性痛的防治提供新的藥物作用靶點。研究結果1.大鼠L5 SNL后PARP-1及其催化產物PAR、以及致炎細胞因子IL-1β和TNF-α在DRG和脊髓中的表達變化(1)L5 SNL模型的建立將實驗用雄性SD大鼠隨機分為實驗組(L5 SNL組,n=10)和對照組(sham組,n=8),參照文獻報道的方法進行L5 SNL手術,測試術前3、1天和術后1、3、5、7、10、14、21、28天的機械刺激撤足閾值(Paw withdrawal threshold,PWT)和熱刺激撤足潛伏期(Paw withdrawal latency,PWL),發(fā)現從術后1天開始大鼠術側后肢PWT和PWL開始顯著下降(與sham組相比較,***P0.001,**P0.01),并且在術后第7天達到最低(與sham組相比較,***P0.001,***P0.001),而對側無明顯變化。(2)L5 SNL后大鼠DRG和脊髓背角PARP-1、PAR及致炎細胞因子IL-1β和TNF-α的表達變化取術后0、1、3、7、10、14天大鼠術側L4-5 DRG和L4-5脊髓進行RT-PCR和qPCR檢測PARP-1 mRNA含量的變化,取對側L4-5DRG和L4-5脊髓進行qPCR檢測PARP-1 mRNA含量的變化,取術側L4-5 DRG和L4-5脊髓進行Western blot檢測PARP-1及其下游產物PAR以及致炎細胞因子IL-1β、TNF-α表達量變化。RT-PCT和qPCR結果顯示L5 SNL可以引起術側L4-5 DRG和L4-5脊髓PARP-1 mRNA含量升高,并在術后第7天或第10天達到最高(與對照組相比,*P0.05,**P0.01,***P0.001,n=3),而對側qPCR結果顯示PARP-1 mRNA含量無明顯變化。Western blot結果顯示,L5 SNL后PARP-1及催化產物PAR以及致炎細胞因子IL-1β、TNF-α的表達量維持在較高水平,并且在第7天表達量最高(與對照組相比,*P0.05,**P0.01,***P0.001,n=3)。以上結果表明L5 SNL可引起大鼠術側L4-5DRG和L4-5脊髓中PARP-1及其催化產物PAR、以及致炎細胞因子IL-1β、TNF-α表達上調。2.大鼠L5 SNL后PARP-1在DRG和脊髓背角表達的細胞類型利用免疫熒光組織化學技術對L5 SNL和正常大鼠的L4-5 DRG和脊髓進行染色拍照觀察,發(fā)現L5 SNL可以引起PARP-1在DRG和脊髓背角表達升高。進一步采用免疫熒光雙染色技術對PARP-1在DRG和脊髓中表達的細胞類型進行了觀察,結果顯示,PARP-1與DRG中的大中型神經元細胞和小型神經元細胞有共定位,與脊髓中的神經元細胞和衛(wèi)星樣膠質細胞有共定位。3.鞘內注射PARP-1抑制劑Tiq-A能夠部分抑制L5 SNL引起的神經病理性痛,同時也可以下調PAR以及致炎細胞因子IL-1β、TNF-α的表達。大鼠L5 SNL后立即鞘內注射PARP-1抑制劑Tiq-A(5、25、50μg/10μl),而后每天1次,連續(xù)5天,同時觀察大鼠的痛行為學變化。結果顯示,與溶劑組(i.t.10μL 10%DMSO生理鹽水)相比較,鞘內注射Tiq-A組大鼠術側后肢PWT和PWL呈劑量依賴性升高(1 d,P0.001;3 d,P0.001;5 d,P0.001;7 d,P0.001;10 d,P0.001;14 d,P0.001,n=8)。Western blot結果顯示,與L5 SNL+Vehicle組相比,高劑量組(i.t.50μg/10μl)術后第7天大鼠術側L4-5 DRG和L4-5脊髓中PAR和致炎細胞因子IL-1β、TNF-α的表達量降低(*P0.05,**P0.01,***P0.001,n=3)。這表明了抑制PARP-1的活性可以部分抑制神經病理性痛的產生,同時也可以抑制L5 SNL引起的大鼠術側L4-5 DRG和L4-5脊髓中PAR、IL-1β、TNF-α表達上調的情況。4.神經病理性痛形成后,鞘內注射PARP-1抑制劑Tiq-A能夠部分逆轉神經病理性痛的癥狀。L5 SNL后第7天開始,對大鼠進行鞘內注射Tiq-A 50μg/10μl每只每天,連續(xù)注射4天,觀察大鼠術側后肢PWT和PWL。結果發(fā)現從注射藥物后開始,大鼠術側后肢的PWT和PWL開始出現明顯升高,并且在停藥后一直持續(xù)到術后第14天(7 d,P0.001;10 d,P0.001;14 d,P0.001,n=7)。說明在神經病理性痛建立之后,抑制PARP-1的活性可以部分逆轉由L5 SNL引起的神經病理性痛。5.鞘內注射PARP-1 siRNA可以部分抑制神經病理性痛的形成。將實驗大鼠隨機分為sham+轉染試劑(Transfection Regant,TR)組、L5 SNL+PARP-1 siRNA組、L5 SNL+Scramble siRNA組、L5 SNL+TR組,每組8只,術后立即注射藥物,siRNA組每天每只1 nmol siRNA,轉染試劑組每天每只10μl轉染試劑,連續(xù)注射5天,同時觀察大鼠痛行為學變化。結果顯示,鞘內注射PARP-1 siRNA組與L5 SNL+TR組相比,大鼠術側后肢PWT在術后3天開始出現明顯升高(***P0.001)并一直持續(xù)到術后第7天(***P0.001)。而術側后肢的PWL在術后1天即出現顯著升高(**P0.01),同樣一直持續(xù)到術后第7天(***P0.001)。Scramble siRNA組與L5 SNL+TR組相比較,沒有統(tǒng)計學差異。Western blot結果顯示,鞘內注射PAPR-1 siRNA可以使術側L4-5 DRG和L4-5脊髓中PARP-1、PAR以及致炎細胞因子IL-1β、TNF-α的表達量降低(與sham+TR組相比較,#P0.05,##P0.01,n=3)。6.運動功能檢測發(fā)現給藥并未對實驗大鼠的運動功能造成影響。連續(xù)給藥后的大鼠在完成機械刺激撤足閾值和熱刺激撤足潛伏期的測試后,進行運動功能檢測。通過放置反射、抓握反射、翻正反射3種測試之后,給藥的大鼠均能保持3種反射的運動功能,沒有運動功能異常的情況出現。結論:大鼠L5 SNL后DRG和脊髓背角PARP-1的表達上調通過調控IL-1β和TNF-α的表達,參與了神經病理性痛的形成和維持。
【圖文】：

果5 SNL 后 PARP-1 及其催化產物 PAR、以TNF-α 在 DRG 和脊髓中的表達變化考 Kim 等人報道的方法[34]，建立模型，并且在術 和 PWL 作為基礎值，測試術后 1、3、5、7、10L 并記錄，發(fā)現在術后 1 天大鼠術側后肢的 PWT（著下降（與 sham 組相比較，*** P ＜ 0.001, ** P在術后 7 天達到最低（與 sham 組相比較，*** P ayANOVA），與文獻報道一致，模型建立成功。

結扎（L5 SNL）引起大鼠熱痛覺過敏。行為學結果顯示假手術側相比，熱刺激撤足潛伏期明顯縮短（與 sham 組1，2-way ANOVA）。術后 0、1、3、7、10、14 天的大鼠取材進行 RT-PCR化，發(fā)現 L5 SNL 可以導致術側 PARP-1 mRNA 在3.4）中含量升高，并且在術后第 7 天達到峰值（與* P ＜ 0.001, 1-way ANOVA）。PCR 結果顯示，，在 L5 SNL 后 PARP-1 mRNA 在術（圖 3.6A）中含量升高，并且在術后第 7 天達 ＜ 0.001 , 1-wayANOVA），而在對側 DRG（3.5B-1 mRNA 無明顯變化。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R741

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本文編號：2611308