【摘要】：膠質(zhì)瘤是最為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤,約占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的27%,約占顱內(nèi)惡性腫瘤的80%,是人類最難治性腫瘤之一~([1])。盡管近年來,手術結合同步放化療的治療策略使患者預后有所改善,但最新的美國腦腫瘤注冊中心(central brain tumor registry of the united states,CBTRUS)顯示膠質(zhì)母細胞瘤的五年生存率仍僅為5.5%,腫瘤內(nèi)部復雜的不均一性是導致其對各種理化因素的抵抗并進展復發(fā)的關鍵~([2])。膠質(zhì)瘤起始細胞(glioma initiating cells,GICs)是一群具有自我更新、無限增殖、多向分化潛能的腫瘤細胞,他們常常分布于腫瘤壞死區(qū)、微血管周圍以及腫瘤組織邊緣,被認為是腫瘤進展和復發(fā)的“主角”~([3])。因此,膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新、侵襲遷移等生物學行為及其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用成為了目前的研究熱點。近來的研究發(fā)現(xiàn),Notch1信號通路在膠質(zhì)瘤干細胞(glioma stem cells,GSCs)中高度激活,Notch1信號通路被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控膠質(zhì)瘤干細胞的增殖、干性維持、分化等行為中發(fā)揮著重要作用~([4]),不同于傳統(tǒng)的依靠游離性配體與細胞表面受體結合的方式激活細胞信號通路,Notch通路的配體與受體均為細胞表面跨膜蛋白,只有通過受體配體細胞相互接觸,才能實現(xiàn)配體與受體的結合而啟動Notch信號~([5])。當Notch通路激活后,γ-分泌酶將發(fā)揮水解作用,使Notch胞內(nèi)域(Notch intracellular domain,NICD)被切割并進入細胞核與轉錄因子CBF1結合,活化下游包括Hes和Hey家族靶基因表達,從而調(diào)節(jié)細胞的生物學行為~([6])。在非小細胞型肺癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤中均已發(fā)現(xiàn)Notch通路可以通過誘導腫瘤細胞表型的上皮間質(zhì)轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),增強其遷移和侵襲能力~([8-10])。在人腦腫瘤中,Notch通路呈異常激活,并且主要富集于腫瘤干細胞中,并調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學行為~([7])。然而,對于Notch信號通路調(diào)控膠質(zhì)瘤干細胞生物學行為的具體機制目前尚未研究清楚。趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor type 4,CXCR4)因被用來提取純化艾滋病毒的幾個趨化因子受體而被認識,近來研究發(fā)現(xiàn),CXCR4在多種腫瘤細胞中表達,在膠質(zhì)瘤細胞中CXCR4也有表達并與腫瘤級別相關,隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增高,CXCR4的表達水平也相應升高,并與患者的生存預后相關~([11])。有研究指出相對于低表達CXCR4的膠質(zhì)瘤病人,高表達CXCR4的膠質(zhì)瘤病人在放化療后有更高的復發(fā)幾率,預后更差~([12])。CXCR4可以與其特異性的配體基質(zhì)細胞衍生因子(Stromal cell-derived factor 1,SDF-1)又稱為趨化因子受體(C-X-C motif chemokine 12,CXCL12)結合,他們在惡性膠質(zhì)瘤細胞的趨化遷移及血管生成中發(fā)揮著極為重要的作用。相對于普通培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞,CXCR4被發(fā)現(xiàn)在GSCs中高度激活,一方面CXCR4可以促進侵襲性偽足形成及基質(zhì)金屬蛋白的分泌來促進膠質(zhì)瘤細胞的侵襲遷移,另一方面CXCR4也可通過PI3k/AKT、ERK等信號通路調(diào)控編碼膠質(zhì)瘤干細胞的增殖、干性維持及侵襲遷移等基因的轉錄。膠質(zhì)瘤干細胞還可以通過自分泌或旁分泌CXCL12來維持自身干性及增殖狀態(tài)~([13])。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)Notch1信號通路分子與CXCR4在膠質(zhì)母細胞瘤組織標本中具有共表達趨勢,它們在蛋白水平的表達均隨著膠質(zhì)瘤病理級別的增高而增高,而針對膠質(zhì)瘤細胞系(包括膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)細胞系、膠質(zhì)瘤起始細胞系)mRNA表達譜也發(fā)現(xiàn),相對于膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)細胞系,Notch1和CXCR4均在膠質(zhì)瘤干細胞中富集,提示在膠質(zhì)瘤干細胞中Notch1和CXCR4可能存在著Crosstalk共同調(diào)控著膠質(zhì)瘤干細胞的生物學行為。本課題主要研究Notch1信號通路在膠質(zhì)瘤起始細胞自我更新和侵襲運動中的作用及其潛在的調(diào)節(jié)機制,研究分為以下四個部分:1.Notch1信號通路分子在膠質(zhì)母細胞瘤中的表達及與預后關系。基因表達譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)在線基因分析Notch1在不同系統(tǒng)腫瘤與對照組織中的mRNA表達比,我們發(fā)現(xiàn)相對于其他系統(tǒng)腫瘤,Notch1在GBM中顯著高表達;生物信息學提取從Oncomine數(shù)據(jù)庫平臺Bredel Brain 2和Sun Brain mRNA數(shù)據(jù)分析并再次驗證Notch1在對照腦組織及膠質(zhì)母細胞瘤組織中的表達差異;生物信息學提取膠質(zhì)瘤TCGA mRNA及臨床資料數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)Hes1表達與膠質(zhì)瘤病人預后相關;GEO數(shù)據(jù)庫采集Notch1和CXCR4在膠質(zhì)瘤干細胞系及傳統(tǒng)細胞系中的mRNA表達譜,結果顯示Notch1和CXCR4在均在GICs中富集,并具有共表達趨勢。2.Notch1對膠質(zhì)瘤起始細胞侵襲遷移、自我更新能力的影響。我們利用慢病毒轉染,建立了Notch1蛋白穩(wěn)定低表達的膠質(zhì)瘤細胞系。用干細胞培養(yǎng)基誘導的方法獲得膠質(zhì)瘤細胞球,并利用免疫磁珠分進一步選出CD133~+的膠質(zhì)瘤細胞。通過Transwell侵襲遷移試驗、熒光基質(zhì)膠降解試驗證實Notch1對膠質(zhì)瘤起始細胞侵襲遷移能力的促進作用。通過細胞球形成試驗、體外極限稀釋試驗證實了Notch1對于膠質(zhì)瘤起始細胞自我更新能力具有維持作用。3.Notch1通過CXCR4介導調(diào)控AKT/mToR通路影響膠質(zhì)瘤起始細胞侵襲遷移、自我更新能力。通過Western blot發(fā)現(xiàn)敲低Notch1可以下調(diào)Hes1、CXCR4、pAKT、pmTOR的蛋白水平的表達,證明了CXCR4和AKT是Notch1通路的下游。隨后添加CXCL12與對照組相比Notch1、Hes1蛋白無明顯變化,而p-AKT、p-mTOR蛋白表達明顯增加,提示在膠質(zhì)瘤起始細胞中,CXCL12/CXCR4趨化因子系統(tǒng)是Notch1信號通路的下游,它的激活可以提高下游AKT/mTOR信號通路的活性。4.體內(nèi)實驗驗證Notch1通過CXCR4調(diào)控膠質(zhì)瘤起始細胞侵襲遷移能力。將不同處理組(shNC組、sh1組和sh2組)的膠質(zhì)瘤起始細胞分別進行裸鼠鼠腦原位種植,觀察并記錄荷瘤鼠飼養(yǎng)過程中的體重、生存期等指標。利用小動物活體成像儀通過荷瘤鼠腫瘤細胞生物發(fā)光的信號強弱來觀察腫瘤生長大小。免疫組織化學染色觀察不同處理組組織標本中Notch1、CXCR4、pAKT等蛋白表達變化。HE(蘇木素伊紅)染色觀察腫瘤組織與正常腦組織交界處邊緣形態(tài)。統(tǒng)計不同處理組小鼠體重、生存時間變化是否具有差異。結果顯示:敲低Notch1可以顯著地減緩腫瘤生長速度,改善小鼠預后,在體內(nèi)微環(huán)境中,Notch1-CXCR4-AKT軸性通路仍然存在。結論:1.Notch1信號通路在膠質(zhì)母細胞瘤中高度激活,Notch1在膠質(zhì)瘤起始細胞中高表達。2.Notch1可以調(diào)控膠質(zhì)瘤起始細胞的侵襲遷移及自我更新能力。3.Notch1通過CXCR4介導作用于AKT/mTOR通路調(diào)控膠質(zhì)瘤起始細胞的侵襲遷移及自我更新能力。4.體內(nèi)實驗驗證Notch1通過CXCR4介導促進膠質(zhì)瘤起始細胞生長及侵襲遷移能力。
【圖文】：

胞癌；KIRC 腎透明細胞癌；KIRP:腎乳頭狀細胞癌；L肝細胞癌；LUAD:肺腺癌；LUSC:肺鱗癌；OV:卵巢漿液:前列腺癌；READ:直腸腺癌；SARC:肉瘤；SKCM：皮膚睪丸生殖細胞腫瘤；THCA:甲狀腺癌；THYM:胸腺癌；肉瘤；）與膠質(zhì)瘤病人預后關系劃圖譜（TheCancerGenomeAtlas,TCGA） 702 例-Ⅲ級膠質(zhì)瘤病人和 172 例膠質(zhì)母細胞瘤病人）獲 Hes1 的 mRNA 表達值及相應病人總生存期s1 表達值中位數(shù)為分割點，繪制 KaplanMeier 生析差異標注 P 值。結果顯示，，與 Hes1 表達高的病的病人（藍線）具有更高的存活率（P<0.001）,這差。

天津醫(yī)科大學碩士學位論文 一、Notch1 信號通路分子在膠質(zhì)母細胞瘤中的表達情況及其與預后關1.2.3 Notch1 信號通路在膠質(zhì)瘤普通細胞系及膠質(zhì)瘤起始細胞系中的表達從 GEO：GSE23806 獲取 36 例膠質(zhì)瘤普通細胞系及 44 例膠質(zhì)瘤起始細胞的 mRNA 數(shù)據(jù)，運用 Morpheus 在線工具進行 mRNA 差異基因聚類分析，從中我們可以看出，Notch1 信號通路中的分子包括 Notch1、Hes1 和 CXCR4 等號通路分子主要在在膠質(zhì)瘤起始細胞系富集而在非膠質(zhì)瘤起始細胞系中表達低。并列舉了膠質(zhì)瘤干細胞的標志物如 CD133(PROM1)和 Nestin(NES)在膠質(zhì)起始細胞和非膠質(zhì)瘤起始細胞中的表達分布予以驗證。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41

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本文編號：2604563