【摘要】：一、研究目的以腦卒中為代表的心腦血管疾病已成為威脅我國居民健康的首要疾病,其中頸動脈狹窄不穩(wěn)定斑塊的脫落是導(dǎo)致腦卒中的重要病因。斑塊內(nèi)部壞死核心與纖維帽動態(tài)平衡是影響動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的決定性因素。胞葬作用是吞噬細(xì)胞清除程序性死亡細(xì)胞的生理過程。在動脈粥樣斑塊中,巨噬細(xì)胞胞葬作用的清除能力可直接影響斑塊內(nèi)壞死核心的大小,胞葬作用水平下降將導(dǎo)致動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性降低。殼多糖酶3樣蛋白1(CHI3L1)是一種與缺血性腦卒中高度相關(guān)的分子標(biāo)記物,本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)CHI3L1在頸動脈狹窄患者血清中升高,且可能與斑塊不穩(wěn)定性相關(guān),目前關(guān)于CHI3L1對動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的影響及其可能的作用機制尚無報道。了解CHI3L1對動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的影響,將有助于腦卒中高�；颊叩脑缙谠\斷及早期治療。因此本課題主要進(jìn)行的研究為明確CHI3L1對動脈粥樣斑塊的影響并探究其具體的作用機制。二、研究方法本課題擬在體內(nèi)臨床樣本、體外細(xì)胞及動物模型水平明確CHI3L1中對患者動脈粥樣斑塊的影響。首先明確頸動脈狹窄患者的斑塊樣本CHI3L1內(nèi)的表達(dá)和分布,同時分離培養(yǎng)人及小鼠的原代巨噬細(xì)胞,研究CHI3L1在體外對巨噬細(xì)胞胞葬作用的影響。隨后利用CHI3L1及其中和抗體干預(yù)已構(gòu)建的頸動脈不穩(wěn)定斑塊小鼠模型,明確CHI3L1在體內(nèi)對巨噬細(xì)胞胞葬作用及斑塊穩(wěn)定性的影響。并利用蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)篩選CHI3L1下游的靶基因,并探究其調(diào)控的具體分子機制。三、研究結(jié)果我們通過臨床樣本的組織切片分析及RNA檢測,明確CHI3L1在不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)水平較高,且主要分布在斑塊壞死核心附近。提取小鼠骨髓巨噬細(xì)胞及人外周血巨噬細(xì)胞后,通過流式細(xì)胞術(shù)及激光共聚焦顯微鏡證明CHI3L1可抑制巨噬細(xì)胞的胞葬作用。在構(gòu)建的頸動脈不穩(wěn)定斑塊小鼠模型中,注射CHI3L1的小鼠與對照組相比,胞葬作用減弱且斑塊較不穩(wěn)定,而予中和抗體注射的小鼠較對照組,胞葬作用較強且斑塊較穩(wěn)定。通過分析臨床樣本及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),篩選出CHI3L1影響胞葬作用的靶基因MFGE8,并通過細(xì)胞實驗進(jìn)行了驗證。通過回補MFGE8后觀察巨噬細(xì)胞胞葬作用變化,證實CHI3L1是通過抑制MFGE8表達(dá)而抑制巨噬細(xì)胞胞葬作用。四、研究結(jié)論本課題證實CHI3L1可降低動脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性。同時本課題通過原代巨噬細(xì)胞的體外實驗及構(gòu)建不穩(wěn)定動脈粥樣斑塊模型小鼠,明確CHI3L1通過下調(diào)胞葬橋接分子MFGE8的表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞的胞葬作用,進(jìn)而導(dǎo)致粥樣斑塊壞死核心增大引起斑塊穩(wěn)定性降低。
【圖文】：

圖 1.1 第一行圖片為無癥狀性染色，圖 1.1 中斑塊標(biāo)本來自行頸動脈內(nèi)膜斑塊切除術(shù)的認(rèn)的研究標(biāo)準(zhǔn)，癥狀性患者的頸動脈斑塊的標(biāo)準(zhǔn)為患者最近 180 天內(nèi)發(fā)生過頸動脈狹窄側(cè)的缺血性腦血管癥狀（腦卒中或短暫性腦缺血發(fā)作）[4,36,37]。我們將頸動脈內(nèi)膜斑塊切除術(shù)取得的斑塊標(biāo)本包埋后切片，連續(xù)的冰凍切片分別進(jìn)行CD68 及 DAPI 染色。通過大的壞死核心和較薄的纖維帽，這意味著斑塊較容易破裂進(jìn)而脫落。而將斑塊內(nèi)部壞死核心的邊緣部分放大后，我們可以發(fā)現(xiàn)在不穩(wěn)定斑塊的壞死核心邊緣，達(dá)較多，且其分布區(qū)域與人巨噬細(xì)胞標(biāo)記這表明CHI3L1在癥狀性患者的癥狀性患者斑塊，第二行圖片為癥狀性患者斑塊。由左至右依次為：CHI3L1 染色，CD68 染色及熒光疊加結(jié)果。斑塊標(biāo)本來自行頸動脈內(nèi)膜斑塊切除術(shù)的頸動脈狹窄患者。認(rèn)的研究標(biāo)準(zhǔn)，癥狀性患者的頸動脈斑塊通常為不穩(wěn)定性斑塊，而癥狀性頸動脈狹窄切片分別進(jìn)行 HE 染色及免疫熒光染色，免疫熒光染色內(nèi)容為HE 染色染色我們可以發(fā)現(xiàn)，不穩(wěn)定斑塊較穩(wěn)定性具有較CD68 的分布基本一致（白色箭頭所指處）�；颊叩膭用}粥樣斑塊中高表達(dá)，且可能影響巨噬細(xì)胞的功能。HE頸動脈狹窄患者。根據(jù)目前公癥狀性頸動脈狹窄熒光染色內(nèi)容為 CHI3L1、CHI3L1 表動脈粥樣斑塊中高表達(dá)，且可能影響巨噬細(xì)胞的功能。

圖 1.2 第一行圖片為穩(wěn)定性斑塊，，第二行圖片為不穩(wěn)定性斑塊DAPI、圖1.2中不穩(wěn)定性斑塊切片來自手術(shù)建立不穩(wěn)定斑塊模型的動脈粥樣硬化模式小鼠（LDL-/-C57）頸動脈斑塊標(biāo)本，穩(wěn)定性斑塊切片來自未手術(shù)的普通動脈粥樣硬化模式小鼠（LDL-/-C57）頸動脈標(biāo)本。手術(shù)造模的主要原理是通過線圈套扎的方法是小鼠頸動脈出現(xiàn)兩處局部性縮窄，導(dǎo)致局部血流動力學(xué)的改變，進(jìn)而引起斑塊穩(wěn)定性的下降[43]。通過對這些斑塊冰凍切片免疫熒光染色的對比我們發(fā)現(xiàn)，未手術(shù)組的小鼠頸動脈僅在動脈壁周圍有少量斑塊附著，手術(shù)造模組的小鼠頸動脈管腔內(nèi)有明顯的粥樣斑塊形成，且以巨噬細(xì)胞（紅色）及非細(xì)胞壞死物質(zhì)為主要成分的壞死核心占據(jù)了粥樣斑塊的大部分區(qū)域，提示斑塊處于不穩(wěn)定狀態(tài)，表明手術(shù)造模成功建立定斑塊模型。而 CHI3L1 （綠色）在不穩(wěn)定斑塊中表達(dá)量較高，其分布區(qū)域與鼠巨噬細(xì)胞標(biāo)記 Mac3 的高度重合（如白色箭頭所指
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R743.3

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本文編號：2592767