【摘要】：研究背景 隨著干細胞移植技術(shù)的逐漸成熟，細胞治療在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應用引起廣泛關(guān)注。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是現(xiàn)如今應用較多的一類具有多向分化能力的成體干細胞，近年研究顯示：從人羊膜中提取而來的羊膜間充質(zhì)干細胞（Amniotic mesenchymal stem cells，AMSCs），由于其相對于胚胎干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞，具有來源廣泛、取材方便、易擴增、多向分化潛能以及免疫原性低等優(yōu)點，同時又避開了胚胎干細胞來源缺乏、倫理道德和法律限制等問題，是目前細胞治療的一種理想的種子細胞來源。越來越多的動物實驗表明，移植羊膜間充質(zhì)干細胞可以改善神經(jīng)功能缺損癥狀，但具體作用機制尚需進一步探討。 小膠質(zhì)細胞（microglia MI）是目前公認的對腦部損傷、炎性以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病進行反應的效應細胞，其主要特征是容易被任何形式的腦損傷或疾病所激活，在多種神經(jīng)系統(tǒng)病變中發(fā)揮著損傷和修復的雙重作用。活化的小膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫反應中發(fā)揮著包括吞噬、免疫炎癥反應、細胞毒性和通過抗原提呈T淋巴細胞的調(diào)節(jié)等作用。MI被激活后釋放的多種細胞因子可引起不同程度的炎癥反應和細胞凋亡，構(gòu)成了“病理級聯(lián)”效應。由此我們推測，在CNS早期的炎癥或損傷過程中如果能調(diào)控MI的活化程度將對控制整個病理或損傷過程非常有利。 CD200屬于白細胞分化抗原,是一種細胞表面的跨膜糖蛋白,其表達范圍較廣，主要在神經(jīng)細胞、胸腺細胞、B細胞T細胞、血管內(nèi)皮細胞等。有研究表明CD200可以表達在羊膜間充質(zhì)干細胞表面。CD200R與其配體CD200均屬于免疫球蛋白超家族，CD200R主要表達在包括小膠質(zhì)細胞在內(nèi)的單核巨噬細胞系統(tǒng)和少量的T細胞上。CD200與CD200R通過細胞間接觸,誘導免疫耐受,傳遞抑制性信號。研究發(fā)現(xiàn),CD200能夠下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài),使小膠質(zhì)細胞誘導產(chǎn)生的細胞因子減少。由此我們設想羊膜間充質(zhì)干細胞也有可能通過這種途徑來調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)MI的活化，進而控制由其觸發(fā)的一系列炎癥級聯(lián)反應的發(fā)生，從而發(fā)揮細胞治療作用。 目的 本實驗研究CD200-CD200R相關(guān)的細胞間接觸途徑,探索CD200在羊膜間充質(zhì)干細胞對小膠質(zhì)細胞免疫調(diào)節(jié)中的作用，以期更全面了解羊膜間充質(zhì)干細胞的作用機制。 第一部分羊膜間充質(zhì)干細胞及小膠質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)及鑒定 方法 1.AMSCs的體外培養(yǎng)及鑒定，分別觀察其原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)細胞生長情況并作出生長曲線；AMSCs的體外誘導分化實驗 2.MI的體外培養(yǎng)、純化及鑒定 3.MI的活化 結(jié)果 1.成功由羊膜組織分離、培養(yǎng)得到的AMSCs具有MSCs的形態(tài)和細胞表面標志，，符合MSCs的生長、增殖特點，流式細胞儀檢測顯示該細胞表達CD73、CDl05，不表達CD45和HLA-DR。AMSCs誘導前不表達NSE，弱表達GFAP，經(jīng)誘導后細胞強表達神經(jīng)細胞特異性標記物NSE、GFAP。 2.成功分離、純化的MI形態(tài)上細胞體呈細長或橢圓,從胞體發(fā)出細小而有分支的突起。CD68免疫熒光染色陽性的細胞達到細胞總數(shù)的95%以上，MI純度較高。 3.MI經(jīng)LPS刺激后活化，細胞呈阿米巴樣外觀，MAC-1免疫熒光陽性，靜息狀態(tài)的MI自身能分泌微量的TNF-α和IL-6，激活后上清液中炎性因子的含量明顯升高，激活前后差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 第二部分羊膜間充質(zhì)干細胞體外調(diào)控小膠質(zhì)細胞活性及其可能機制研究 方法 1.免疫熒光染色法檢測AMSCs表面CD200的表達；ELISA檢測P2-P6AMSCs上CD200的表達。 2.免疫熒光染色法檢測MI表面CD200R的表達；ELISA檢測P1-P4MI上CD200R的表達。 3.AMSCs與MI體外共培養(yǎng)及抗CD200抗體阻斷實驗。建立AMSCs和MI共培養(yǎng)體系，實驗分組如下：MI組、MI+LPS組、MI+LPS+AMSCs組、MI+LPS+AMSCs+抗CD200抗體組、MI+LPS+AMSCs transwell組,共培養(yǎng)48h后觀察各組細胞的形態(tài);ELISA檢測各組上清中炎性因子TNF-α和IL-6的表達,免疫熒光法、ELISA檢測各組細胞表面CD200R的表達。 結(jié)果 1.AMSCs表達CD200，且P2-P6CD200的表達呈遞增趨勢,至P6表達增加明顯,P2與P6差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.0001)。 2.MI表達CD200R，CD200R在各代MI表面均有表達，與P1相比，其余各代OD值均升高，但各代間相比無顯著差異（P＞0.05）。 3.在LPS作用下上清液中TNF-α和IL-6的分泌量較MI組顯著增加，而在LPS+MI+AMSCs組中，當有AMSCs存在時，兩種炎性因子的分泌量呈明顯下降趨勢，LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗體組培養(yǎng)48h后，兩種細胞因子分泌量較LPS+MI+AMSCs組上升，但仍低于LPS+MI組；Transwell組兩種細胞因子分泌量較LPS+MI+AMSCs組明顯升高，與LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗體組比較無明顯差異。 4.免疫熒光法可見每組均有CD200R陽性細胞，MI+LPS組較MI組熒光強度稍減弱，MI+LPS+AMSCs組CD200R比MI+LPS組明顯增強，抗CD200抗體組、Transwell組較MI+LPS組無明顯差異。 5.MI+LPS組CD200R的表達較MI組有所減少，當有AMSCs存在時，CD200R的表達呈顯著上升趨勢，LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗體組培養(yǎng)48h后，CD200R的表達較LPS+MI+AMSCs組下降，但與LPS+MI組比較無明顯差異，Transwell組CD200R的表達較LPS+MI+AMSCs組明顯降低，與LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗體組比較差異不明顯。 統(tǒng)計學方法 所有統(tǒng)計分析均用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(x±s)表示，兩組間比較采用T檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，P0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論 1.AMSCs表面表達CD200，MI表面表達CD200R。 2.AMSCs與MI共培養(yǎng)可使活化MI表面CD200R的表達上調(diào)，通過CD200-CD200R的直接接觸對活化的MI發(fā)揮免疫抑制作用，調(diào)節(jié)MI的活化程度，減少炎性細胞因子分泌,抗CD200抗體能夠逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。
【圖文】：

顯示，細胞在接種后的2-8天為生長的洲細胞逐漸開始出現(xiàn)貼壁，無明顯擴增;8天以后細胞進入對數(shù)生長期，增殖活湘差顯微鏡下觀察可見細胞突起向四周伸展，出?

原代培養(yǎng)生長曲線
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R741;R457.7

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 喬東訪;崔桐輝;王慧君;譚曉輝;李艷紅;;氧化應激條件下CD200對MG炎性反應的調(diào)控作用[J];熱帶醫(yī)學雜志;2008年10期

2 李慧;顧健;林傳明;馬莉;沈連軍;吳蔚;汪中強;;臍帶間充質(zhì)干細胞對CIA大鼠炎癥因子的干預[J];中國組織工程研究與臨床康復;2011年36期

3 劉萍萍;李倩如;朱敬松;軒小燕;管莎莎;杜英;;間充質(zhì)干細胞移植對EAE小鼠Treg細胞功能的影響[J];中國免疫學雜志;2013年10期

本文編號：2581724