【摘要】：目的:探討孕酮對(duì)抗腺苷三磷酸(ATP)誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護(hù)作用和機(jī)制。方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞按照孕酮或ATP濃度的不同進(jìn)行分組,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率,YO-PRO-1染色檢測(cè)細(xì)胞膜通透性,Fluo-3染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度的變化,Western blot法檢測(cè)嘌呤能P2X_7受體表達(dá)的變化。結(jié)果:與對(duì)照組相比,不同濃度(1、3、5和7 mmol/L)ATP作用2 h,SH-SY5Y細(xì)胞存活率顯著降低(P0.05),細(xì)胞攝入YO-PRO-1的熒光強(qiáng)度明顯增加(P0.05),且呈劑量依賴性。濃度為3、10和30 nmol/L的孕酮預(yù)孵育30 min可減輕ATP損傷作用,細(xì)胞存活率較單純ATP組明顯升高(P0.05或P0.01)。孕酮(30nmol/L)或P2X_7受體拮抗劑KN-62(500 nmol/L)預(yù)孵育30 min均可顯著抑制ATP誘導(dǎo)的胞內(nèi)YO-PRO-1的熒光增強(qiáng)(P0.01),而孕酮和KN-62兩者之間沒(méi)有明顯差異。正常組細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量少,ATP組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度較對(duì)照組明顯增高(P0.05),孕酮(30 nmol/L)或KN-62(500 nmol/L)預(yù)孵育30 min可明顯降低(P0.05)ATP誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣熒光增強(qiáng),而孕酮和KN-62兩者之間的作用無(wú)明顯差異。ATP組SH-SY5Y細(xì)胞P2X_7受體表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(P0.05),而孕酮(30 nmol/L)預(yù)孵育30 min則可顯著降低ATP誘導(dǎo)的P2X_7受體表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:孕酮可抑制ATP誘導(dǎo)的P2X_7受體表達(dá)、膜孔形成和胞內(nèi)Ca~(2+)升高,降低細(xì)胞死亡率,明顯減輕高濃度ATP對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作用。
【圖文】：

H-SY5Ycells．Mean±SEM．n=3．＊＊P＜0.01vscontrolgroup;#P＜0.05，##P＜0.01vsATPgroup．圖3孕酮對(duì)ATP損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響4孕酮對(duì)ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞膜孔形成的影響熒光顯微鏡下觀察YO-PＲO-1的結(jié)果，與對(duì)照組相比，，ATP組胞內(nèi)YO-PＲO-1熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，而孕酮+ATP組和KN-62+ATP組熒光信號(hào)明顯低于ATP組。多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果示，孕酮+ATP組和KN-62+ATP組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度分別為103.9%和98.23%，均明顯低于ATP(5mmol/L)組的120.5%(P＜0.01)，而與對(duì)照組無(wú)顯著差別(P＞0.05)，見(jiàn)圖4。5孕酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的影響正常細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量少且穩(wěn)定。ATP處理組平均熒光值隨著ATP作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高，即Figure4．Theeffectofprogesterone(PＲOG)andKN-62onYO-PＲO-1uptakeinducedbyATPintheSH-SY5Ycells(×400)．Mean±SEM．n=3．＊＊P＜0.01vscontrolgroup;##P＜0.01vsATPgroup．圖4孕酮和KN-62對(duì)ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞攝入YO-PＲO-1的影響胞內(nèi)鈣離子逐漸增高。與ATP組相比，孕酮+ATP組和KN-62+ATP組胞內(nèi)鈣離子均明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)圖5。6孕酮對(duì)ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞P2X7受體表達(dá)的影響Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，ATP處理后SH-SY5Y細(xì)胞P2X7受體蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，而預(yù)先給予孕酮預(yù)孵育，P2X7受體蛋白表達(dá)水平則明顯低于ATP處理組(P＜0.05)，由此看來(lái)孕酮能抑制ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞P2X7受體蛋白表達(dá)的上調(diào)，見(jiàn)圖6。討論至今繼發(fā)性腦損傷仍缺乏理想的治療方法和手段，而孕酮作為神經(jīng)甾體對(duì)腦損傷的保護(hù)作用已有較多的報(bào)道。許多動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)表明，孕酮可延緩神經(jīng)細(xì)胞的壞死、凋亡，促進(jìn)血腦屏障重建，減少炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減輕腦水腫，促進(jìn)神經(jīng)髓鞘合成［7

Figure5．Theeffectofprogesterone(PＲOG)andKN-62onCa2+concentrationsinducedbyATPinSH-SY5Ycells(×400)．Mean±SEM．n=3．＊＊P＜0.01vscontrolgroup;##P＜0.01vsATPgroup．圖5孕酮和KN-62對(duì)胞外ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響Figure6．Theeffectofprogesterone(PＲOG)ontheproteinex-pressionofP2X7receptor(P2X7Ｒ)inducedbyATPintheSH-SY5Ycells．Mean±SEM．n=3．＊＊P＜0.01vscontrolgroup;#P＜0.05vsATPgroup．圖6孕酮對(duì)ATP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞P2X7受體表達(dá)的影響腦組織ATP主要由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放，且具有遞質(zhì)活性，故稱為膠質(zhì)遞質(zhì)。生理情況下胞內(nèi)ATP達(dá)mmol/L濃度，胞外μmol/L水平。胞外μmol/L水平的ATP可激活P2X7Ｒ，形成陽(yáng)離子通道，介導(dǎo)Ca2+、Na+內(nèi)流以及K+外流，使細(xì)胞去極化，維持神經(jīng)細(xì)胞正常興奮活動(dòng)。而在腦外傷、腦缺血、炎癥等些病理情況下，受傷局部的膠質(zhì)細(xì)胞釋放出大量ATP及其降解產(chǎn)物，且向鄰近區(qū)域擴(kuò)散，高濃度ATP長(zhǎng)時(shí)間或者反復(fù)刺激細(xì)胞膜上P2X7Ｒ，形成允許各種陽(yáng)離子和900D以下的有機(jī)物質(zhì)通過(guò)的“膜孔”，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡而死亡。膜孔形成可加速Ca2+內(nèi)流，引起鈣超載，使膠質(zhì)細(xì)胞釋放致炎因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)，加重腦組織損傷［13］。Suadicani等［14］采用表達(dá)P2X7受體的人類膠質(zhì)細(xì)胞瘤1321N1細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，發(fā)現(xiàn)苯甲酰苯甲酸腺嘌呤核苷三磷酸可使胞內(nèi)Ca2+濃度、YO-PＲO-1攝取及ATP釋放明顯增加。有研究表明ATP作用于分化的NG108-15神經(jīng)細(xì)胞，激活P2X7受體后不僅引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，而且通過(guò)三磷酸肌醇受體介導(dǎo)鈣釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［15］。因此鈣超載也是P2X7Ｒ產(chǎn)生毒性作用的重要因素。

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本文編號(hào)：2570453