【摘要】：【研究背景】缺血性腦卒中(Cerebral ischemia stroke),是神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的急重癥之一,是指各種腦血管先天發(fā)育異常以及后天因素(高血壓、高脂血癥、糖尿病等)引起的腦血管管腔狹窄、閉塞或堵塞,從而導致局部或全腦腦血流灌注銳減或中斷而引發(fā)的一種疾病。缺血性腦卒中其發(fā)病率、致殘率及致死率均高,嚴重威脅我國人民健康及生活質量。隨著醫(yī)學的發(fā)展,缺血再灌注治療(包括急性溶栓、介入取栓或支架置入及血管搭橋等)在臨床得到廣泛應用,也取得較好的療效。然而,在獲得缺血再灌注治療益處的同時,其也可引起明顯的腦缺血再灌注損傷,嚴重影響治療效果。研究發(fā)現(xiàn),多種致傷機制均參與其中,如鈣超載、興奮性毒性、氧化應激及內(nèi)質網(wǎng)應激等。已有大量研究旨在闡明腦缺血再灌注損傷的致傷機制及尋找其潛在的干預靶點,然而,目前情形并不容樂觀。容量性鈣內(nèi)流(Capacity calcium entry,CCE)是細胞內(nèi)鈣動態(tài)平衡的重要調節(jié)機制,通過感應內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)鈣濃度,調控CCE復合體形成,介導外鈣內(nèi)流,補充細胞內(nèi)及鈣庫內(nèi)鈣。CCE復合體主要由鈣濃度感應分子——基質相互作用分子(Stromal interaction molecule,STIM)、鈣釋放激活的鈣通道(Ca~(2+)release-activated Ca~(2+)channels,CRACs)及相關調節(jié)蛋白構成。氧化應激、鈣庫排空及細胞酸化等因素可激活CCE,形成CCE復合體,調控神經(jīng)元存活,參與急、慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展。如前所述,氧化應激、鈣超載等均參與腦缺血再灌注損傷,那么CCE是否在其中發(fā)揮作用,及其具體機制如何,目前尚不可知�！狙芯磕康摹勘狙芯恐荚�:(1)明確腦缺血再灌注損傷中,CCE主要構成分子時空變化規(guī)律及其作用;(2)探討調控CCE所介導的神經(jīng)保護機制;(3)尋找潛在的CCE內(nèi)源性調控分子,為腦缺血再灌注損傷治療提供新的思路或潛在的干預靶點。【研究方法】1、采用原代海馬神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注(Oxygen-glucose deprivationreperfusion,OGD/Rep.)模型體外模擬腦缺血再灌注損傷;采用谷氨酸誘導的HT-22細胞系氧化應激模型研究Homer1a與CCE間相互作用關系;2、采用實時定量PCR技術及蛋白免疫印跡(Western Blot,WB)檢測OGD/Rep.處理后CCE構成分子、凋亡及自噬相關分子的mRNA及蛋白水平改變;3、采用乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)釋放量檢測評價神經(jīng)元損傷情況,采用原位末端標記(Terminal dUTP nick end labelling,TUNEL)方法檢測神經(jīng)元凋亡改變;4、采用轉染STIM1、STIM2及內(nèi)質網(wǎng)等熒光蛋白標記質粒及免疫熒光染色技術可視化CCE構成分子空間定位變化;5、采用慢病毒介導的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)及CRISPR/Cas9技術調控神經(jīng)元STIM1、STIM2及Homer1a表達水平;6、采用轉染LC3-GFP及mRFP-GFP-LC3熒光蛋白標記質�？梢暬窠�(jīng)元自噬及自噬流改變;7、采用CCE、鈣調素依賴的蛋白激酶II(Calmodulin-Dependent Protein Kinase II,CaMKII)及自噬藥物抑制劑或激動劑調控其活性;8、采用Fluo-4 AM、Fura-red AM及胞漿鈣熒光指示蛋白監(jiān)測CCE介導的鈣內(nèi)流及胞漿內(nèi)鈣水平改變;9、采用蛋白質免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,co-IP)技術檢測蛋白分子間相互作用。【研究結果】第一部分研究發(fā)現(xiàn):OGD/Rep.處理后,CCE主要構成分子,包括STIM1、STIM2、Orai1、Orai2及TRPC1 mRNA及蛋白水平均無明顯改變,然而,胞漿內(nèi)STIM1斑塊數(shù)明顯增加;抑制CCE可明顯減輕OGD/Rep.引起的神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣超載;下調或敲除STIM1表達或應用CCE藥物抑制劑均可明顯減輕OGD/Rep.誘導的神經(jīng)元損傷,抑制其凋亡,促進神經(jīng)元存活。本部分研究表明,CCE參與OGD/Rep.介導的神經(jīng)元損傷的致傷機制,抑制CCE可發(fā)揮神經(jīng)保護作用。第二部分研究發(fā)現(xiàn):OGD/Rep.處理后,神經(jīng)元自噬水平增加,但同時也存在一定程度的自噬降解受阻;藥物激動劑激活自噬可減輕OGD/Rep.介導的神經(jīng)元損傷;CCE抑制可發(fā)揮類似自噬激動劑的作用,在激活神經(jīng)元自噬的同時,并一定程度改善自噬降解受阻;進一步研究發(fā)現(xiàn),OGD/Rep.處理后,CaMKII磷酸化水平明顯增加,而抑制CaMKII活性可明顯下調雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)磷酸化水平,促進自噬激活,減輕神經(jīng)元損傷;抑制CCE后,CaMKII及mTOR磷酸化水平均明顯下降,且CCE抑制及mTOR抑制所介導的神經(jīng)保護作用并無明顯疊加效應。本部分研究表明,抑制CCE可一方面通過抑制CaMKII-mTOR信號,促進自噬形成,同時另一方面也可改善自噬降解受阻,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。第三部分研究旨在尋找CCE潛在的內(nèi)源性負性調控分子,為排除離子型谷氨酸受體的影響,特采用谷氨酸誘導的HT-22細胞系氧化應激模型,研究發(fā)現(xiàn):氧化應激損傷后,STIM1及Orai1蛋白水平無明顯改變,而STIM1胞漿內(nèi)斑塊數(shù)明顯增加,并逐漸向細胞膜靠近;下調或敲除STIM1表達或采用CCE藥物抑制劑均可減輕神經(jīng)元氧化應激損傷;上調Homer1a表達則可明顯抑制CCE所介導的鈣內(nèi)流、氧化應激所引起的晚期細胞內(nèi)鈣超載及線粒體氧化應激損傷,發(fā)揮類似CCE抑制所介導的神經(jīng)保護作用;此外,co-IP發(fā)現(xiàn)STIM1、Homer1a及Orai1間存在明顯蛋白相互作用,上調Homer1a蛋白表達可明顯抑制谷氨酸引起的STIM1-Orai1復合體形成。以上實驗結果表明,抑制CCE可減輕神經(jīng)元氧化應激損傷,而Homer1a可通過抑制STIM1-Orai1復合體形成負性調控CCE,發(fā)揮神經(jīng)保護作用�！狙芯拷Y論】本研究首先證實,CCE參與腦缺血再灌注損傷的致傷機制,抑制CCE可發(fā)揮神經(jīng)保護作用;該神經(jīng)保護作用其機制可能與促進自噬發(fā)生、改善自噬降解障礙及抑制凋亡有關;此外,本研究還發(fā)現(xiàn)一種CCE內(nèi)源性負性調控分子——Homer1a,其可通過負性競爭抑制STIM1-Orai1復合體形成,抑制CCE,介導神經(jīng)保護作用。以上研究進一步揭示了腦缺血再灌注損傷的致傷機制,也發(fā)現(xiàn)了該致傷機制的內(nèi)源性調控分子,為缺血性腦卒中的治療提供了新的切入點及干預靶點。
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一、缺血性腦卒中研究現(xiàn)狀1、腦卒中流行病學及分類腦卒中，即腦血管意外（俗稱腦中風），是神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的急重癥之一，是指各種腦血管先天發(fā)育異常以及后天因素（高血壓、高脂血癥、糖尿病等）引起的腦血管管壁破裂或者管腔狹窄、閉塞或堵塞，從而導致局部或全腦腦血流灌注銳減或中斷而引發(fā)的一組疾病，主要表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺失。其發(fā)病率高，達 258/10 萬人，致殘、致死率也均較高，據(jù)文獻報道，腦卒中是 60 歲以上老人的第二大死因，是15-59 歲人民的第五大死因[1]。而在我國，據(jù) Circulation 報道，年齡標準化流行率、發(fā)病率和死亡率為 1114.8/10 萬人，246.8 和 114.8/10 萬人/年（圖 1-1），已成我國人民的頭號死因及成人首要致殘原因[3, 4]。

第四軍醫(yī)大學博士學位論文種被動死亡方式。然而，近些年研究表明壞死并非僅僅如此，在發(fā)現(xiàn) Caspase 非依賴的細胞死亡，，表現(xiàn)出細胞壞死的特征性改變。是程序化的細胞內(nèi)信號轉導的結果。2005 年，Yuan 等人的將其命凋亡樣壞死。細胞凋亡是細胞自殺的一個過程，包括細胞皺縮、A 片段化及凋亡小體形成等等。生化水平上，凋亡特征性表現(xiàn)為磷 Caspase 激活。研究提示，缺血性腦卒中延遲性細胞死亡主要為細一動態(tài)調節(jié)的過程，有助于清除氧化蛋白、脂質及受損細胞器，噬小體形成，然而其在缺血性腦卒中中的作用目前爭議較大[11]。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R743.3


本文編號：2565964