【摘要】：第一章匹羅卡品顳葉癲癇小鼠模型的建立及癲癇后海馬神經元和膠質細胞病理改變的研究 目的：建立C57BL/6小鼠匹羅卡品顳葉癲癇模型,探討癲癇后小鼠海馬神經元和膠質細胞病理改變。 方法：6-8周齡健康雄性C57BL/6小鼠隨機分為實驗組和對照組。實驗組腹腔注射匹羅卡品誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE),對照組腹腔注射等量無菌生理鹽水。SE后觀察小鼠行為學表現(xiàn)并記錄慢性期自發(fā)性癇性發(fā)作(SS)。SE后2h,24h,7d,15d,60d分別行海馬組織NeuN和GFAP免疫組化染色,并以同樣的分組方法檢測相同數(shù)量的對照組小鼠。 結果： 1.造模成功率為48.0%,總體死亡率為40.3%。模型小鼠在慢性期SS的發(fā)生率為87.5%,平均潛伏期為11.1+4.8天。SS多在晝夜交替時出現(xiàn),持續(xù)時間一般為10-40秒,通常不超過1分鐘。 2. NeuN免疫組化染色：匹羅卡品致SE后小鼠海馬CA1-CA3區(qū)各層、齒狀回門區(qū)均有不同程度的神經元缺失。其中CA1區(qū)在24小時以后,神經元損傷持續(xù)存在(P0.05),門區(qū)神經元損傷在SE后2h即出現(xiàn),之后也無恢復；CA3區(qū)神經元早期有丟失,SE后7天有所恢復,慢性期后又再次出現(xiàn)CA3區(qū)神經元的損傷；DG區(qū)在SE后7天有短暫上升,余時間點變化相對不明顯,少數(shù)情況下可見顆粒細胞呈現(xiàn)彌散化現(xiàn)象。 3. GFAP免疫組化染色：膠質細胞對癇性發(fā)作的反應在形態(tài)學上來說比神經元出現(xiàn)要晚,在SE后24h時細胞出現(xiàn)水腫樣表現(xiàn),表現(xiàn)為CA1、CA3及門區(qū)陽性表達面積增加(P0.05),；7d后各區(qū)域陽性表達面積增加明顯(P0.05)；進入慢性期(2m)后陽性染色面積介于對照組和7d之間,形成膠質瘢痕。 結論： 1.匹羅卡品顳葉癲癇小鼠模型表現(xiàn)出典型的海馬神經元丟失及膠質增生病理改變。 2.C57BL/6小鼠匹羅卡品模型是一種理想的顳葉癲癇模型。 第二章Pannexin通道蛋白在匹羅卡品顳葉癲癇小鼠海馬的表達變化 目的：探討Pannexin通道蛋白在匹羅卡品顳葉癲癇小鼠海馬的表達變化 方法：6-8周齡健康雄性C57BL/6小鼠隨機分為實驗組和對照組。實驗組腹腔注射匹羅卡品誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE),對照組腹腔注射等量無菌生理鹽水。SE后2h,24h,7d,15d,60d分別行海馬組織Panxl和Panx2免疫組化染色及Panx1、Panx2與NeuN、 GFAP的熒光雙標染色。 結果： 1.在正常對照組,Panxl和Panx2均表達于CA1-CA3區(qū)錐體細胞層,在始層、透明層及輻射層可見Panx陽性神經元的散在分布；在齒狀回結構中,顆粒細胞呈現(xiàn)陽性表達,齒狀回分子層及門區(qū)亦可見Panx蛋白的散在表達；SE后Panx1和Panx2在海馬主細胞層表達呈下降趨勢,而Panx1在非主細胞區(qū)域(尤其是輻射層)表達增加。 2. Panx1、Panx2與NeuN熒光雙標：在正常對照組,基本上所有Panx1及Panx2陽性的細胞均表現(xiàn)出NeuN染色陽性。雙標記的Panx1Panx2陽性神經元,在CA1、CA3椎體細胞層7d時減至最低；Hilar區(qū)雙標記的神經元在SE后各時期均下降 3.Panx1、Panx2與GFAP熒光雙標：在對照組中,GFAP陽性的細胞均未見Panx1Panx2的表達,SE后的2h、7d、15d、60d可以觀察到Panx1與GFAP共表達細胞,以CA1、CA3始層、輻射層最為明顯,SE后7d及15d最為顯著；整個過程中均未觀察到Panx2與GFAP雙重染色的細胞。 結論： 1.匹羅卡品顳葉癲癇小鼠海馬Panx1和Panx2通道蛋白存在動態(tài)表達變化。 2.SE后Panx1通道蛋白在小鼠海馬星形膠質細胞中顯著表達。 第三章Pannexin通道對顳葉癲癇小鼠癇性發(fā)作及海馬神經元.膠質細胞可塑性的調控 目的：探討在活體內阻斷Panx通道對匹羅卡品誘導的癇性發(fā)作的影響,并觀察慢性期(SE后60d)海馬神經元及膠質細胞病理的變化。 方法：6-8周齡健康雄性C57BL/6小鼠,隨機分為Cbx干預組、10Panx干預組及ACSF對照組,分別予側腦室注射Cbx、10Panx及ACSF。5小時后行匹羅卡品顳葉癲癇模型制作。在給藥后2個小時內觀察第一次出現(xiàn)3級發(fā)作的間隔時間、各級別癇性發(fā)作所占的比例及死亡率。SE后60d各組小鼠分別行海馬組織NeuN和GFAP免疫組化染色。 結果： 1.癲癇敏感性測定結果顯示：10Panx干預組及Cbx干預組出現(xiàn)第一次3級或以上發(fā)作的平均時間分別為71.40±37.33min及59.53±34.69min,均較ACSF對照組(18.10+6.45min)顯著延長。此外,各組癇性發(fā)作的嚴重程度也有不同,空白對照組5級以上發(fā)作占50%,而10Panx干預組及Cbx干預組5級以上發(fā)作分別僅占20%及13.3%。2小時內三組的死亡率分別為20%(10Panx干預組),13%(Cbx干預組)及40%(ACSF對照組)。 2. NeuN免疫組化染色：SE后60天各組小鼠海馬CA1-CA3區(qū)各層、齒狀回門區(qū)均有不同程度的神經元缺失。與ACSF對照組相比,10Panx干預組及Cbx干預組在SE后60天海馬CA1、CA3區(qū)錐體細胞層神經元受損相對較輕(P0.05),10Panx干預組門區(qū)神經元也可觀察到同樣現(xiàn)象(P0.05),DG區(qū)差異相對不明顯。 3. GFAP免疫組化染色：三組均可觀察到膠質細胞的形態(tài)學改變。10Panx干預組及Cbx干預組在海馬CA1區(qū)及Cbx干預組在DG區(qū)膠質增生均較對照組程度輕(P0.05),其余區(qū)域膠質增生在干預組及對照組并無顯著差異。 結論： 1.在活體阻斷Panx通道可以抑制匹羅卡品誘導的癇性發(fā)作。 2. Panx通道可能參與顳葉癲癇海馬神經元-膠質細胞可塑性的調控。
【圖文】：

海馬冠狀切面結構圖示

倍、40倍物鏡下觀察各區(qū)膠質細胞形態(tài)改變。膠質細胞增生的分析使用ImageTool軟件(UTHSC) [17](圖1-2)。首先設定一個代表陽性染色的閾值，達到閾值的染色區(qū)域將由系統(tǒng)自動轉變成純黑色，而之外的區(qū)域則變?yōu)榧儼咨珔^(qū)域，軟件自動計算出黑色區(qū)域占整個切片區(qū)域的百分比，由此來計算膠質細胞的增生程度。：’".k- ■ - .Jt圖1-2使用ImageTool軟件分析膠^閬赴鏨�。A為SE后60d模型小鼠CA3區(qū)GFAP免疫組化染色原圖（x4()0 ); B為軟件處理后的黑白圖像。1.2.5.4統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（S±s)表示，成組設計多樣本均數(shù)用單因素方差分析（ANOVA)或Wilcoxon秩和檢驗，實驗組與對照組間比較用兩樣本t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗，檢驗水準a=0.05。統(tǒng)計分析和圖表繪制分別用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件和 Microsoft Office Excel 2010 進行。1.3結果1.3.1 Pilo致TLE模型小鼠的行為學觀察1.3.1.1模型小鼠SE的行為學特點對照組及實驗組小鼠腹腔注射東莨菪堿硝酸甲酯后，，未表現(xiàn)特殊反應；實驗組小鼠注射匹羅卡品5?15分鐘后
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742.1

【參考文獻】

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1 ;Cx31 is assembled and trafficked to cell surface by ER-Golgi pathway and degraded by proteasomal or lysosomal pathways[J];Cell Research;2005年06期

2 楊忠旭,欒國明,閆麗,張穎;顳葉癲癇大鼠模型的建立及長期癲癇敏感性的研究[J];中華醫(yī)學雜志;2004年02期

本文編號：2547833