【摘要】：重癥肌無力(myasthenia gravis, MG)是累及神經(jīng)肌肉接頭處的某些成分而導(dǎo)致突觸后膜信號傳導(dǎo)障礙的一種自身免疫病,以反復(fù)出現(xiàn)的肌肉收縮無力,用力時惡化,休息后緩解為特征。在80%～85%的MG患者中,其主要的靶抗原是肌肉的乙酰膽堿受體(muscle acetylcholine receptor, AChR)。單鏈抗體(single-chain fragment variable, scFv)是由免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)(variable region of heavy chain, VH)和輕鏈可變區(qū)(variable region of light chain, VL)經(jīng)一條柔軟可彎曲的肽鏈連接而成。scFv完整的保留了抗原結(jié)合的能力,由于它沒有抗體的Fc段,因此不能激活補體。然而,scFv小分子的生理特點決定了它可以從體內(nèi)經(jīng)腎臟快速清除。scFv637是MG抗原特異性scFv,由人AChR a亞單位上67～76位氨基酸(即主要免疫原區(qū),main immunogenic region, MIR)組成。它可以結(jié)合MG患者血清中的抗MIR的自身抗體,從而保護人AChR,這使它有可能成為一種MG特異性免疫抑制治療劑。與scFv一樣,scFv637具有快速從血液中清除的缺點。因此,在本項研究中,我們將scFv637基因與半壽期較長的人血漿白蛋白(human serum albumin, HSA)基因連接,以延長scFv637的半壽期,增加其在血中的穩(wěn)定性。這使得scFv有可能成為MG的一種特異性免疫抑制劑。 目的：制備單鏈抗體融合人血清白蛋白,以延長單鏈抗體的半壽期并增加其在血中的穩(wěn)定性,為重癥肌無力的免疫治療奠定基礎(chǔ)。 方法：將scFv637與HSA基因連接后轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌(Pichia pastoris)中表達出融合蛋白scFv637-HSA。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡試驗確定其分子量；通過免疫熒光試驗檢測融合蛋白scFv637-HSA與人肋間肌AChR的結(jié)合情況；經(jīng)競爭性ELISA檢測融合蛋白抑制MG患者血清中的自身抗體與AChR的結(jié)合能力,以及融合蛋白在健康血清中的穩(wěn)定性。 結(jié)果：融合蛋白在畢赤酵母菌中成功表達,其分子量約為89kD；免疫熒光試驗結(jié)果顯示,融合蛋白可以與人肋間肌神經(jīng)肌肉接頭處的AChR結(jié)合；經(jīng)12例MG患者血清檢測發(fā)現(xiàn),融合蛋白對AChR的抑制率為2%～77.4%；融合蛋白在靜態(tài)健康血清中可以維持大約3天。 結(jié)論：成功制備出scFv-HSA融合蛋白,并且其保留了保護AChR的能力。這使得scFv-HSA融合蛋白有望成為一種特異性免疫抑制治療MG的手段。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R746.1

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本文編號：2542369