【摘要】：周?chē)窠?jīng)損傷，尤其是節(jié)段性缺損損傷，長(zhǎng)久以來(lái)都是臨床醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)。長(zhǎng)節(jié)段缺損造成患區(qū)感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能缺失，且恢復(fù)緩慢，恢復(fù)效果不佳，是最為嚴(yán)重的創(chuàng)傷之一，致殘率高。目前，周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)方法雖已多種多樣，但仍以自體神經(jīng)移植作為“金標(biāo)準(zhǔn)”。除傳統(tǒng)的神經(jīng)斷端吻合、自體/異體神經(jīng)移植外，其他治療方法如新型神經(jīng)組織工程材料的開(kāi)發(fā)與使用、種子細(xì)胞的培養(yǎng)與使用、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的復(fù)合使用、電刺激療法及新藥物的研制正被廣泛開(kāi)發(fā)和研究。但是以上方法僅注意修復(fù)效果是否接近于自體神經(jīng)移植，卻忽略了神經(jīng)損傷瓦勒氏變性本身需要較長(zhǎng)時(shí)間這一問(wèn)題。因此，尋找一種既注重修復(fù)效果又能縮短治療時(shí)間的方法具有重要臨床意義。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗半乳糖神經(jīng)酰胺抗體和豚鼠補(bǔ)體聯(lián)用制備免疫性脫髓鞘劑可以促進(jìn)擠壓傷和橫斷傷后周?chē)窠?jīng)修復(fù)和再生。但是，何種配比下能達(dá)到最好的脫髓鞘效果不得而知；再者，脫髓鞘劑作用的原理也不甚明了；第三，這種脫髓鞘劑能否促進(jìn)長(zhǎng)節(jié)段神經(jīng)缺損的恢復(fù)尚未研究。因此，本研究通過(guò)對(duì)脫髓鞘劑配比優(yōu)化、脫髓鞘劑有效性、細(xì)胞正負(fù)性作用和其對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)15mm缺損自體神經(jīng)修復(fù)后神經(jīng)再生的促進(jìn)作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究。以闡明脫髓鞘劑作用原理，評(píng)價(jià)其促神經(jīng)生長(zhǎng)能力。主要分為四個(gè)部分進(jìn)行研究： 第一部分免疫性脫髓鞘反應(yīng)藥物的配比優(yōu)化 目的：優(yōu)化脫髓鞘劑配比，證明脫髓鞘劑有效性。 方法：通過(guò)不同配比濃度的脫髓鞘劑對(duì)正常坐骨神經(jīng)作用進(jìn)行比較，采用甲苯胺藍(lán)染色及透射電鏡的方法觀(guān)察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，篩選最優(yōu)方案。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)4種配比的脫髓鞘劑對(duì)坐骨神經(jīng)的脫髓鞘作用均有效且并無(wú)明顯差別。甲苯胺藍(lán)染色和透射電鏡結(jié)果顯示4種脫髓鞘劑對(duì)神經(jīng)的作用表現(xiàn)相同趨勢(shì)。甲苯胺藍(lán)染色1d時(shí)顯示多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞腫脹、萎縮，排列稀疏，髓鞘邊緣出現(xiàn)不整，厚薄不均等情況；電鏡結(jié)果1d時(shí)顯示髓鞘普遍開(kāi)始皺縮，板層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂或顯示不清，部分神經(jīng)元開(kāi)始萎縮變性。而1w時(shí)無(wú)論是甲苯胺藍(lán)染色還是透射電鏡結(jié)果均顯示正常神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)已大部分消失，僅殘留很少新生有髓神經(jīng)元。在電鏡圖片中對(duì)有髓神經(jīng)元數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)各配比間有髓神經(jīng)元數(shù)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05）。 結(jié)論：按抗Gal-C抗體/豚鼠補(bǔ)體原液絕對(duì)含量比=1:1的配比，配制步驟簡(jiǎn)單，減少藥品污染和浪費(fèi)，避免PBS溶液的干擾，優(yōu)化后續(xù)實(shí)驗(yàn)分組，被認(rèn)為是最優(yōu)配比。并將此配比方案運(yùn)用到后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 第二部分：免疫性脫髓鞘劑對(duì)神經(jīng)元及雪旺細(xì)胞的影響 目的：為驗(yàn)證脫髓鞘劑本身對(duì)主要神經(jīng)元細(xì)胞和雪旺細(xì)胞的影響，以確定脫髓鞘劑的安全可靠性，并佐證了脫髓鞘劑促神經(jīng)生長(zhǎng)的原理。 方法：利用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)較高純度背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，并用常規(guī)方法培養(yǎng)高純度雪旺細(xì)胞。將脫髓鞘劑加入背根神經(jīng)節(jié)感覺(jué)神經(jīng)元、脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以及雪旺細(xì)胞中，通過(guò)免疫熒光染色和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析觀(guān)察免疫性脫髓鞘劑對(duì)各種細(xì)胞的影響。 結(jié)果：通過(guò)以上方法培養(yǎng)出（93±5）%純度的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、（83±6）%純度的脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以及（92±2）%純度的雪旺細(xì)胞，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。加入脫髓鞘劑后，免疫性脫髓鞘劑對(duì)上述三種細(xì)胞均無(wú)促進(jìn)生長(zhǎng)或增殖作用或毒性作用。其中檢測(cè)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元加入脫髓鞘劑和去離子水對(duì)照組培養(yǎng)后軸突長(zhǎng)度分別為827.6±23.1和835.9±22.8；脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元加入脫髓鞘劑和去離子水對(duì)照組培養(yǎng)后軸突長(zhǎng)度分別為374.6±24.7和377.2±26.1。雪旺細(xì)胞加入脫髓鞘劑和去離子水對(duì)照組培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量分別為168537.3±12657.4和170519.1±13324.4。均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05）。而利用活死細(xì)胞染色檢測(cè)各組細(xì)胞，僅出現(xiàn)極個(gè)別死亡細(xì)胞。但是脫髓鞘劑對(duì)雪旺細(xì)胞有改變形態(tài)的作用，由梭形變?yōu)槿切位蚨噙呅巍?結(jié)論：通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，免疫性脫髓鞘劑對(duì)神經(jīng)元及雪旺細(xì)胞均無(wú)正性及負(fù)性作用，但是它會(huì)對(duì)雪旺細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，推測(cè)和它作用原理有關(guān)。 第三部分免疫性脫髓鞘藥物對(duì)大鼠長(zhǎng)節(jié)段缺損的修復(fù)效果及機(jī)制的研究 目的：評(píng)價(jià)脫髓鞘劑單一組分對(duì)神經(jīng)的作用以及驗(yàn)證免疫性脫髓鞘劑對(duì)長(zhǎng)節(jié)段神經(jīng)缺損的促生長(zhǎng)作用。進(jìn)一步闡明脫髓鞘劑促進(jìn)生長(zhǎng)的原理。 方法：通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、透射電鏡、免疫組織化學(xué)、逆行示蹤、RT-PCR、生物行為學(xué)等方法，從形態(tài)和功能綜合評(píng)價(jià)免疫性脫髓鞘劑的促神經(jīng)生長(zhǎng)作用。并探索脫髓鞘劑促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的機(jī)制。 結(jié)果：通過(guò)將脫髓鞘劑和各組分成分單一注射對(duì)比，證明了只有當(dāng)脫髓鞘劑兩種組分同時(shí)存在時(shí)，免疫性脫髓鞘反應(yīng)才會(huì)發(fā)生，單獨(dú)注射各個(gè)組分對(duì)神經(jīng)幾乎沒(méi)有影響。坐骨神經(jīng)指數(shù)分析方面可以看出，注射脫髓鞘劑組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值優(yōu)于各對(duì)照組，說(shuō)明其促進(jìn)靶肌肉運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的能力是肯定的。透射電鏡中分析神經(jīng)元數(shù)量、再生神經(jīng)面積、有髓神經(jīng)平均直徑及髓鞘化程度證明免疫性脫髓鞘劑在各個(gè)觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)可以明顯促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)（p0.05）；熒光金逆行示蹤、肌肉HE染色和神經(jīng)免疫組化雙標(biāo)染色都顯示脫髓鞘劑在促神經(jīng)再生和功能恢復(fù)方面具有明顯的作用（p0.05）；RT-PCR反應(yīng)結(jié)果顯示免疫性脫髓鞘劑通過(guò)超敏反應(yīng)使周?chē)窠?jīng)發(fā)生脫髓脫失，提前瓦勒氏變性過(guò)程，闡明了免疫性脫髓鞘劑的作用原理和促神經(jīng)生長(zhǎng)原理。 結(jié)論：綜上可以看出，免疫性脫髓鞘劑可以明顯通過(guò)提前瓦勒氏變性脫髓鞘其進(jìn)程的作用來(lái)縮短神經(jīng)再生需要的時(shí)間，促進(jìn)有利微環(huán)境的提早形成，促進(jìn)神經(jīng)再生和患肢功能恢復(fù)。是一種全新理念的治療長(zhǎng)節(jié)段缺損的新方法。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R745

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2534663