【摘要】：背景:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二常見的神經(jīng)退行性疾病,主要臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)異常,其病理特征是腹側(cè)中腦黑質(zhì)致密部?jī)?nèi)多巴胺能神經(jīng)元選擇性、進(jìn)行性缺失,受累的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)Lewy小體。Lewy小體主要成分為α-synuclein蛋白,PD也因此被重新定義為一種在腦內(nèi)形成Lewy神經(jīng)突和Lewy小體的多系統(tǒng)突觸蛋白病。組胺是一種自體活性物質(zhì)和炎性介質(zhì),是外周組織和器官過敏及炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。20世紀(jì)70年代,組胺在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用逐漸被揭示。目前已知組胺是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì),通過其4個(gè)受體H1-H4參與諸多神經(jīng)功能與活動(dòng),也介入到多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制中。前人的研究顯示PD中組胺系統(tǒng)處于活躍狀態(tài),且H1、H2受體拮抗劑具有保護(hù)PD多巴胺能神經(jīng)元的作用,而組胺H3和H4受體在PD黑質(zhì)內(nèi)的作用則鮮有報(bào)道。為闡明該作用及相關(guān)機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)首先以魚藤酮(Rotenone,Rot)單側(cè)毀損大鼠黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元建立PD大鼠模型,觀察組胺H3和H4受體拮抗劑對(duì)PD黑質(zhì)內(nèi)多巴胺神經(jīng)元的影響;其次,在此基礎(chǔ)上重點(diǎn)闡明了H4受體拮抗劑保護(hù)PD中多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)元外小膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)制;最后,觀察了H4受體拮抗劑對(duì)Rot誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型(SH-SY5Y細(xì)胞)的影響,以明確H4受體拮抗劑是否具有直接保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用。方法:1.模型制備和給藥:選擇36只成年雄性SD大鼠,采用腦立體定位技術(shù)向動(dòng)物右側(cè)黑質(zhì)致密部局部注射12μg魚藤酮,并固定側(cè)腦室插管。側(cè)腦室分別給予組胺H4受體拮抗劑JNJ7777120、組胺H3受體拮抗劑Carcinine和M1型小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑Donepezil。所有藥物,5μg/day,日一次,連續(xù)3周。2.動(dòng)物分組、行為及組織檢測(cè):動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為兩批進(jìn)行。第一批實(shí)驗(yàn):動(dòng)物分為Rot模型及上述3個(gè)藥物組,給藥3周后以4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌流,留取腦組織進(jìn)行酪氨酸羥化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)、鈣離子結(jié)合分子-1(ionized calcium binding adapter molecule-1,IBA-1)、α-突觸核蛋白(α-synuclein)的免疫組化染色。由于H3受體拮抗劑未顯示出任何明顯作用,第二批動(dòng)物只保留H4拮抗劑組及Rot模型和空白對(duì)照組。造模后每周進(jìn)行阿撲嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為檢測(cè),3周后斷頭取腦,分離各組動(dòng)物雙側(cè)紋狀體和腹側(cè)中腦,-80℃保存樣本。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)法檢測(cè)紋狀體內(nèi)多巴胺(dopamine,DA)的含量,q PCR法檢測(cè)腹側(cè)中腦內(nèi)組胺H4受體、組胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(Histamine N-methyltransferase,HMT)、CD86、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、CD206、精氨酸酶1(arginase 1,Arg1)的表達(dá)。3.SH-SY5Y細(xì)胞實(shí)驗(yàn):以100n M魚藤酮與SH-SY5Y細(xì)胞孵育72小時(shí),CCK法檢測(cè)組胺H4受體拮抗劑JNJ7777120對(duì)100n M Rot處理的SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響。同時(shí),以免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Western blot法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)α-synuclein的表達(dá)。結(jié)果:1.免疫組化結(jié)果顯示:Rot組大鼠毀損側(cè)黑質(zhì)致密部?jī)?nèi)多巴胺合成限速酶TH陽性神經(jīng)元明顯降低,為對(duì)側(cè)的43%(P0.05);而H4受體拮抗劑JNJ7777120明顯提高TH陽性細(xì)胞數(shù)量,增加至Rot組的160%(P0.05)。組胺H3受體拮抗劑Carcinine則無明顯變化。2.與Rot組相比較,組胺H4受體拮抗劑JNJ7777120明顯降低了PD大鼠阿撲嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為,第1-3周分別為Rot組的43%、59%、29%(P0.05);提高了紋狀體內(nèi)的DA含量,較Rot組增加約88%(P0.05);且降低組胺H4受體和組胺代謝酶HMT的表達(dá),分別較Rot組降低了4.9倍和1.9倍(P0.05)。3.Rot組大鼠毀損側(cè)黑質(zhì)內(nèi)則出現(xiàn)大量α-synuclein陽性小體,為對(duì)側(cè)的210%(P0.05);而組胺H4受體拮抗劑JNJ7777120明顯降低α-synuclein陽性小體數(shù)目,較Rot組降低34%(P0.05)。4.Rot組大鼠毀損側(cè)黑質(zhì)致密部小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白IBA-1陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加,為對(duì)側(cè)數(shù)量的222%(P0.05);H4受體拮抗劑JNJ7777120明顯降低IBA-1陽性細(xì)胞數(shù)量,較Rot組降低41%(P0.05)。q PCR結(jié)果顯示,H4受體拮抗劑JNJ7777120僅顯著抑制M1亞型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD86和其釋放產(chǎn)物IL-1β的表達(dá)。5.SH-SY5Y細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示:CCK檢測(cè)發(fā)現(xiàn)100n M魚藤酮作用SH-SY5Y細(xì)胞72h可以降低細(xì)胞存活率至對(duì)照組的69%,而不同濃度的組胺H4受體拮抗劑JNJ7777120對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力下降無明顯影響。免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Western blot法檢測(cè)顯示,魚藤酮可明顯上調(diào)細(xì)胞內(nèi)α-synuclein的表達(dá),而H4受體拮抗劑JNJ7777120則對(duì)魚藤酮引起的α-synuclein的上調(diào)無明顯影響。結(jié)論:組胺H4受體拮抗劑對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的損傷具有保護(hù)作用,其細(xì)胞外機(jī)制與H4受體拮抗劑可以抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖與釋放有關(guān),而H4受體拮抗劑是否可以直接作用于多巴胺能神經(jīng)元仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)闡明。本研究為PD臨床治療發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)提供理論依據(jù),也拓展了組胺H4受體在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中的作用與價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R742.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 Geertu Deli;Masatoshi Makuuchi;;Immunohistochemical assessment of angiogenesis in hepatocellular carcinoma and surrounding cirrhotic liver tissues[J];World Journal of Gastroenterology;2005年07期

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本文編號(hào)：2531329