發(fā)布時間：2019-06-05 04:13

【摘要】：目的：癲癇是指神經(jīng)元自發(fā)的，反復的，，刻板的放電發(fā)作。癲癇可以導致認知、情感、行為方面異常。癲癇病灶部位、發(fā)作類型及社會心理因素均可影響認知，近幾年研究發(fā)現(xiàn)抗癲癇藥物本身也有導致認知損傷的副作用。氧化應激參與了許多神經(jīng)變性疾病的生理病理過程，近來研究發(fā)現(xiàn)氧化應激同樣存在于癲癇的發(fā)病機制之中。癲癇發(fā)作過程伴有氧自由基生成增多，大腦是脂質過氧化物敏感的器官,其中海馬神經(jīng)元氧化應激損傷是癲癇大鼠認知功能障礙發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一。α-硫辛酸（α-Lipoicacid ALA）是一種體內(nèi)強抗氧化劑，具有潛在的預防和治療癲癇所致認知功能障礙的作用。目前α-硫辛酸多用于用來預防甚至治療某些疾病如：糖尿病及其并發(fā)癥、神經(jīng)系統(tǒng)退化及肝功能失調等癥狀。而α-硫辛酸在改善癲癇所致的認知障礙中的作用尚未見報道。本實驗通過建立杏仁核電點燃慢性癲癇大鼠模型，并給予α-硫辛酸干預，用Western Blot方法觀察鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱa(calciurn/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ a，CaMKⅡa)及磷酸化鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱa（P-CaMKⅡa)蛋白在海馬組織中的表達水平，用免疫組織化學方法觀察磷酸化鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱa（P-CaMKⅡa)在大鼠海馬組織中的蛋白表達水平及分布情況，用Nissl染色方法觀察大鼠海馬組織的形態(tài)學情況,并用Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶能力。初步探討α-硫辛酸對癲癇認知障礙有無神經(jīng)保護作用及其可能的作用機制。 方法：將72只7-8周，體重250-300g之間，成年雄性Wistar大鼠隨機分為：正常對照組（NC組）、假手術組(S組）、癲癇組（E組）、正常α-硫辛酸組(ALA組）、α-硫辛酸低劑量組（20mg/kgALA+E組）和α-硫辛酸高劑量組（40mg/kgALA+E組），每組各12只大鼠。正常對照組：不做任何處理；假手術組：杏仁核植入電極；癲癇組：杏仁核植入電極后每天按120%發(fā)作閾值刺激一次；正常α-硫辛酸組：不做任何處理的大鼠硫辛酸按40mg/kg腹腔注射；α-硫辛酸低劑量組和α-硫辛酸高劑量組：于每天上午08:30-09:30之間分別腹腔注射α-硫辛酸20mg/kg和α-硫辛酸40mg/kg，藥物注射完30min后，按120%發(fā)作閾值刺激1次/日，共15次。結束后觀察1小時。依據(jù)Becker等改良的Racine分級標準觀察：0級：無任何反應，呈正常的行為狀態(tài)；1級：濕狗樣抖動、面肌痙攣如眨眼、動須及節(jié)律性咀嚼；2級：頸部肌肉痙攣表現(xiàn)為點頭和（或）甩尾；3級：一側前肢陣攣；4級：雙側前肢陣攣伴站立；5級：全身陣攣，失去平衡，跌倒。連續(xù)3次獲得Ⅳ級或Ⅳ級以上的運動性驚厥的大鼠為完全點燃。最后一次給藥結束后24小時，行Morris水迷宮檢測，實驗前l(fā)天大鼠在水池內(nèi)自由游泳2min，熟悉環(huán)境。實驗包括（1）可視平臺實驗：為排除實驗處理因素對動物實驗感覺、視覺、知覺及運動功能的差異對空間學習記憶的影響，采用可視平臺對大鼠進行測試。平臺升至液面上2cm，每只大鼠釋放4次，分別從不同的4個入水點入水，記錄大鼠的逃避潛伏期。（2）定位航行實驗：用于測試大鼠的學習能力。正式實驗歷時4天。以后4天每天分上、下午兩個時間段，每段訓練4次，中間間隔2h。訓練時隨機選取一個象限中心作為入水點，將大鼠面向池壁輕輕放入水中，每個時間段4次訓練分別從4個不同的入水點入水。記錄大鼠從入水到爬上水下平臺的時間，即逃避潛伏期。如120s大鼠仍未找到平臺，由操作者將大鼠引上平臺休息30s，并將潛伏期記錄為120s，兩次訓練中間間隔60s；（3）空間探索實驗：用于測試大鼠的空間記憶能力。定位航行實驗完畢的第二天，將平臺撤除，選定和平臺區(qū)域相對的象限中點為入水點，記錄大鼠在120s內(nèi)為搜尋平臺而穿越平臺的次數(shù)。行為學測試結束后:（1）每組各取6只大鼠灌注取腦，Nissl染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)及損傷情況。同時用免疫組織化學方法檢測P-CaMKⅡa在海馬CA1區(qū)的表達情況；（2）每組另取6只大鼠，斷頭取腦，快速分離海馬，用Wester blot方法檢測海馬CaMK Ⅱa及P-CaMKⅡa蛋白水平變化。 結果： 1水迷宮結果：可視平臺試驗: NC組、ALA組、S組、E組大鼠、20mg/kgALA+E組及40mg/kgALA+E組之間比較逃避潛伏期無明顯統(tǒng)計學差異（P0.05）。 定位航行實驗：以各組大鼠每日逃避潛伏期均值進行比較。(1)第1天，E組大鼠的逃避潛伏期與NC組相比有所延長；與E組相比，20mg/kgALA+E組、40mg/kg ALA+E組、ALA組、S組的逃避潛伏期均有所縮短，但各組間比較無統(tǒng)計學意義(PO.05)。(2)第2天，各組大鼠逃避潛伏期均比第1天明顯縮短(P0.05);E組大鼠的逃避潛伏期與NC組相比明顯延長(P0.05)；與E組相比，20mg/kg ALA+E組、40mg/kg ALA+E組、ALA組、S組的逃避潛伏期均有所縮短(P0.05)，但與NC組比較無統(tǒng)計學意義(PO.05)。(3)第3天，各組大鼠逃避潛伏期均比第2天明顯縮短(P0.05);NC組、E組、20mg/kg ALA+E組、40mg/kg ALA+E組、ALA組、S組的逃避潛伏期相互比較結果與第2天相同。(3)第4天，各組大鼠逃避潛伏期均比第3天又有明顯縮短(P0.05); NC組、E組、20mg/kgALA+E組、40mg/kg ALA+E組、ALA組、S組的逃避潛伏期相互比較結果與第3天相同。 空間探索試驗：E組大鼠與NC組大鼠相比，穿越平臺次數(shù)明顯減少（p0.05）；與E組相比，20mg/kgALA+E組及40mg/kgALA+E組穿越平臺次數(shù)明顯增多（p0.05），且與NC組、ALA組、S組比較無明顯統(tǒng)計學意義（p0.05）。 2Nissl染色結果：NC組、ALA組及S組大鼠的海馬神經(jīng)元結構完整，細胞漿內(nèi)尼氏小體豐富，染色質分布均勻，核仁清晰，無明顯神經(jīng)元丟失；與NC組相比，E組大鼠海馬細胞皺縮，胞漿內(nèi)尼氏小體明顯減少，染色質凝集成塊、核固縮、神經(jīng)元丟失明顯；20mg/kg ALA+E組及40mg/kgALA+E組海馬神經(jīng)元結構正常，有少量染色質凝集，胞漿內(nèi)尼氏小體較E組顯著增加，僅少量神經(jīng)元丟失。 3免疫組化結果：P-CaMKⅡa蛋白在海馬組織中的陽性細胞顯示為棕褐色，主要在細胞的胞漿內(nèi)表達。E組的P-CaMKⅡa在海馬表達的陽性細胞數(shù)較NC組明顯降低（P0.05）。與E組比較，20mg/kgALA+E組和40mg/kgALA+E組的P-CaMKⅡa蛋白在海馬表達的陽性細胞數(shù)明顯升高（P0.05）。且20mg/kg ALA+E組及40mg/kg ALA+E組與NC組、ALA組、S組之間比較無明顯統(tǒng)計學差異（P0.05）。 4Western blot檢測結果：CaMKⅡa蛋白在各組大鼠海馬表達水平以CaMKⅡa/GAPDH表示。E組CaMKⅡa蛋白表達水平較NC組明顯降低(P0.05)。20mg/kg ALA+E組和40mg/kg ALA+E組的CaMKⅡa蛋白表達水平較E組明顯升高(P0.05)。S組、NC組、ALA組、20mg/kgALA組+E組及40mg/kgALA組+E組之間比較無統(tǒng)計學意義（P0.05）。 P-CaMKⅡa蛋白在各組大鼠海馬表達水平以P-CaMKⅡa/GAPDH表示。E組P-CaMK Ⅱa蛋白表達水平較NC組明顯降低(P0.05)。20mg/kgALA+E組和40mg/kg ALA+E組的P-CaMK Ⅱa蛋白表達水平較E組明顯升高(P0.05)。S組、NC組、ALA組、20mg/kgALA組+E組及40mg/kgALA組+E組之間比較無統(tǒng)計學意義（P0.05）。 結論： 1本實驗采用杏仁核電點燃慢性癲癇大鼠模型可以很好地模擬人類癲癇后認知功能障礙，是研究癲癇后認知障礙的理想模型。 2癲癇可導致CaMK Ⅱa和P-CaMK Ⅱa蛋白表達下降，并導致腦組織受損，提示CaMK Ⅱa及P-CaMK Ⅱa可能與癲癇后認知障礙相關。 3α-硫辛酸可以上調癲癇后海馬組織中CaMK Ⅱa及P-CaMK Ⅱa蛋白的表達水平，改善癲癇后認知障礙，并減輕腦組織的損害，提示α-硫辛酸可改善癲癇后認知障礙并對腦組織有一定保護作用，這種作用可能是通過調節(jié)CaMK Ⅱa及P-CaMK Ⅱa蛋白活性及抗氧化應激作用來實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742.1

【共引文獻】

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本文編號：2493247