【摘要】：研究背景世界發(fā)達(dá)國家和新的經(jīng)濟(jì)增長體國家(如我國)都存在人口老齡化問題,老齡人群的快速增長已經(jīng)為社會醫(yī)療和公共衛(wèi)生服務(wù)帶來了巨大挑戰(zhàn)。無法回避的事實(shí)是相當(dāng)比例的老年人正在經(jīng)歷著各種類型的疼痛。據(jù)調(diào)查,養(yǎng)老院里高達(dá)80%的老年人存在至少一項(xiàng)疼痛問題,超過40%的人正在經(jīng)歷難以忍受的疼痛。而老齡化過程本身也是各種類型疼痛的主要易感因素。研究顯示,有些慢性痛的發(fā)病率隨增齡而提高,如難治的頑固性外周神經(jīng)病理性痛(帶狀皰疹后神經(jīng)痛、糖尿病性神經(jīng)痛)、中樞神經(jīng)病理性痛(如中樞中風(fēng)后疼痛)和痛性骨關(guān)節(jié)變性病等多發(fā)生在老年人,而青年人少見,提示老年痛具有特殊的生物學(xué)機(jī)制,但機(jī)制至今不清。最近我們實(shí)驗(yàn)室在新生、成熟和老化10幾個年齡大鼠的研究上發(fā)現(xiàn),無論在外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)還是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS),粗大的有髓神經(jīng)纖維都最早出現(xiàn)變性樣改變,我們把這個現(xiàn)象叫做髓鞘病變(myelinopathy)。髓鞘病變組織病理上可被分為I-III級,I級只累及髓鞘本身(如致密層解開、空泡、崩解、斷裂),而iii級可累及軸突并導(dǎo)致其發(fā)生顯著的變性。本博士學(xué)位論文在以往研究的基礎(chǔ)上,重點(diǎn)觀察和分析了軀體感覺初級傳入神經(jīng)元的外周突(如坐骨神經(jīng))和中樞突(脊髓后索)老化的年齡變化特點(diǎn),然后探索髓鞘病變對脊髓背角(疼痛信息處理與加工的門戶)的影響,期望從髓鞘病變的分子和細(xì)胞機(jī)制上找到老年痛發(fā)生的身體易感因素。研究目的1.觀察大鼠軀體感覺系統(tǒng)外周和中樞神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)的年齡相關(guān)性變化;2.檢測大鼠脊髓神經(jīng)纖維髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)水平的年齡相關(guān)性變化;3.檢測大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的年齡相關(guān)性活化狀態(tài);4.評價(jià)大鼠年齡對軀體感覺、軀體運(yùn)動和模型大鼠痛行為的影響;5.探討大鼠軀體感覺系統(tǒng)神經(jīng)纖維老化變性的可能分子機(jī)制。研究意義應(yīng)用電鏡、免疫熒光等形態(tài)學(xué)方法,結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)和行為學(xué)手段,從軀體感覺系統(tǒng)神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)的年齡相關(guān)性改變、膠質(zhì)細(xì)胞年齡相關(guān)性活化、正常大鼠及神經(jīng)病理性痛模型大鼠年齡相關(guān)性痛行為變化和炎性因子在老化過程中的動態(tài)改變等多個方面去探討老年痛的可能機(jī)制。希望能夠從老化相關(guān)髓鞘病變的發(fā)生發(fā)展中尋找老年痛發(fā)生的生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)因素。實(shí)驗(yàn)方法本課題應(yīng)用透射電鏡技術(shù)觀察大鼠軀體感覺系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)的年齡相關(guān)性變化;應(yīng)用免疫學(xué)方法(免疫熒光和免疫印跡)檢測大鼠脊髓中髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)水平的年齡相關(guān)性變化和大鼠脊髓內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的年齡相關(guān)性活化狀態(tài);應(yīng)用行為學(xué)手段評價(jià)大鼠軀體感覺、軀體運(yùn)動的年齡相關(guān)性改變及年齡對疼痛模型大鼠痛行為的影響。最后為了探討大鼠年齡相關(guān)性軀體感覺、軀體運(yùn)動改變的可能機(jī)制,我們應(yīng)用免疫標(biāo)記和免疫印跡的方法檢測不同年齡大鼠hmgb1及其受體rage的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.大鼠軀體感覺系統(tǒng)神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)的年齡相關(guān)性變化大鼠軀體感覺系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出顯著的年齡相關(guān)性改變。生后2月齡大鼠坐骨神經(jīng)和脊髓后索有髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)基本完整,且基質(zhì)結(jié)構(gòu)電子密度均勻。而12月齡時,其中部分有髓神經(jīng)纖維發(fā)生了髓鞘病變。生后26月齡時,有髓神經(jīng)纖維的病變更加明顯,絕大部分髓鞘都出現(xiàn)了腫塊形成、異源性物質(zhì)沉積、髓鞘冗余、施-蘭切跡崩解、內(nèi)向或/和外向髓鞘褶皺、軸索擠壓變形等。最終累及軸突發(fā)生退行性改變(軸突變性)。此外,老齡時期,基質(zhì)成分丟失顯著,纖維間距離增大。坐骨神經(jīng)中無髓神經(jīng)纖維也發(fā)生了年齡相關(guān)性的病理改變。生后2個月大鼠坐骨神經(jīng)無髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)完整,呈現(xiàn)由施旺細(xì)胞單層突起包裹的數(shù)根纖維為一組的神經(jīng)束狀結(jié)構(gòu),而12月齡時,個別軸突中出現(xiàn)空泡樣變性,但還未累及施旺細(xì)胞。26月齡時,病理變化加劇,束內(nèi)的無髓纖維膜結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,單根纖維結(jié)構(gòu)不清,軸突內(nèi)有空泡,電子致密度異常增高。此月齡,施旺細(xì)胞發(fā)生變性壞死,進(jìn)而其包繞的無髓纖維發(fā)生整束的壞死,呈現(xiàn) 黑葡萄樣‖結(jié)構(gòu)。脊髓后索是粗大的初級傳入有髓纖維進(jìn)入后形成的上行纖維束路,觀察顯示其存在與外周同樣的病理改變,少突膠質(zhì)細(xì)胞也出現(xiàn)變性樣改變。為了更好的對髓鞘結(jié)構(gòu)的年齡相關(guān)性變化進(jìn)行定量分析,我們使用本實(shí)驗(yàn)室提出的病理分級方法,對神經(jīng)纖維病變進(jìn)行分級定量。結(jié)果提示,坐骨神經(jīng)中病變的有髓神經(jīng)纖維和無髓神經(jīng)纖維所占比例均隨年齡增長顯著增加;脊髓后索中病變的有髓神經(jīng)纖維所占比例隨年齡增長顯著增加。2.大鼠脊髓中樞髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)水平的年齡相關(guān)性變化大鼠脊髓中樞髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著的年齡相關(guān)性改變。2月齡大鼠脊髓后索髓鞘相關(guān)蛋白(o1、cnp、galc、mog等)依髓鞘結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出完整的圓環(huán)狀。dapi染色顯示后索內(nèi)細(xì)胞胞核均勻、散在分布。而老齡時期,髓鞘相關(guān)蛋白含量顯著下降,特別是mog、cnp和galc,dapi陽性細(xì)胞核密度減少明顯,并出現(xiàn)了細(xì)胞核聚集的現(xiàn)象。對脊髓細(xì)胞骨架分子進(jìn)行標(biāo)記,結(jié)果顯示nf200的含量在老齡大鼠后索有小幅度的減少。用mbp和nf200雙標(biāo)顯示,少突膠質(zhì)細(xì)胞的突起穿行于神經(jīng)纖維之間形成髓鞘,但老齡時的一個顯著特征是在mbp和nf200共標(biāo)記的纖維周圍�？梢娒芗男≈睆郊�(xì)胞核聚集,而聚集細(xì)胞中dapi與mbp基本不共存,提示是非髓鞘形成細(xì)胞的核聚集所致。后續(xù)鑒定顯示,聚集的細(xì)胞核與gfap不共存,但與iba1有共存現(xiàn)象,提示聚集細(xì)胞是小膠質(zhì)細(xì)胞。對脊髓背根神經(jīng)節(jié)(drg)細(xì)胞進(jìn)行分類標(biāo)記,結(jié)果顯示無論是drg大細(xì)胞,亦或是中小細(xì)胞均未隨年齡的增長發(fā)生數(shù)量上的改變。而對皮膚神經(jīng)纖維標(biāo)記后發(fā)現(xiàn),神經(jīng)纖維數(shù)量在中、老齡大鼠皮膚顯著下降。同時,我們也檢測了坐骨神經(jīng)中髓鞘相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果提示坐骨神經(jīng)中cnp、pmp22和mbp的蛋白表達(dá)水平隨年齡增長顯著下降;老齡時期細(xì)胞骨架標(biāo)記物(nf200)的表達(dá)水平也明顯的下降。3.大鼠脊髓中樞小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的年齡相關(guān)性活化狀態(tài)大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生了年齡相關(guān)性的活化增強(qiáng)。青齡大鼠脊髓中iba1陽性細(xì)胞很少,而在老齡時期,iba1陽性細(xì)胞大量增加,小膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯。與白質(zhì)區(qū)域(后索)相比,老齡大鼠灰質(zhì)內(nèi)(背角)小膠質(zhì)細(xì)胞活化更為顯著。后索中iba1陽性細(xì)胞密度老齡較青齡增加了約2倍,而在背角中,增加幅度接近4倍之多。且老化時,被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出胞體和突起變大。與小膠質(zhì)細(xì)胞相似,老齡時期星形膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯,但分布灰、白質(zhì)間無明顯差別。4.大鼠年齡對軀體感覺、軀體運(yùn)動和疼痛反應(yīng)行為的影響我們分別利用pwmt、pwtl評價(jià)大鼠軀體感覺變化,利用rot-rod評價(jià)軀體運(yùn)動功能年齡相關(guān)性改變。結(jié)果提示老齡動物(26月齡)械痛敏閾值顯著升高、熱痛敏潛伏期顯著延長。軀體運(yùn)動功能評價(jià)結(jié)果與軀體感覺類似,老齡時期,大鼠運(yùn)動功能發(fā)生顯著下降,在rot-rod上停留時間降低了幾十倍。但當(dāng)評價(jià)年齡對不同疼痛模型大鼠痛行為影響時發(fā)現(xiàn),無論是炎性痛模型還是神經(jīng)損傷痛模型,老齡大鼠痛時程顯著延長。綜合上述,提示老齡大鼠熱和機(jī)械痛閾均提高(對痛遲鈍),但炎性痛和神經(jīng)病理性痛更易持續(xù)慢性化。5.老齡大鼠軀體感覺系統(tǒng)髓鞘病變的可能分子機(jī)制探索在前述結(jié)果的基礎(chǔ)上,我們認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘和軸索發(fā)生崩解破壞后產(chǎn)生的物質(zhì)會激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng),惡化原有損傷,引起一系列痛行為。因此檢測了晚期炎癥因子hmgb1及其受體表達(dá)的年齡相關(guān)性變化。結(jié)果提示,hmgb1及其受體rage在中、老齡動物脊髓后索、背角中顯著高表達(dá)。與其高表達(dá)同時發(fā)生的還有膠質(zhì)細(xì)胞的大量活化。與中樞神經(jīng)系統(tǒng)類似,hmgb1在坐骨神經(jīng)中的表達(dá)也具有年齡相關(guān)性,老齡時期顯著增高3倍以上。RAGE在老齡時期的表達(dá)也增高了約20%。結(jié)論:1.髓鞘結(jié)構(gòu)的病理改變具有年齡相關(guān)性,隨年齡增長其破壞程度不斷加重。提示在老化過程中,神經(jīng)系統(tǒng)中髓鞘可能是最易受累的組織結(jié)構(gòu),同時也可能是最主要的老化作用靶點(diǎn)。2.髓鞘相關(guān)蛋白在老齡時期顯著表達(dá)下調(diào),使得髓鞘板層結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性遭到破壞,這可能是髓鞘結(jié)構(gòu)出現(xiàn)年齡相關(guān)性病理改變的物質(zhì)基礎(chǔ)。3.正常大鼠老齡化過程伴隨機(jī)械痛刺激閾值升高和熱痛刺激潛伏期顯著延長,提示痛敏感性降低,但老齡化可以延長痛反應(yīng)的時程,提示老齡大鼠疼痛更易持續(xù)慢性化。4.小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在老化時均出現(xiàn)活化增強(qiáng),且在出現(xiàn)退行性改變的髓鞘旁有小膠質(zhì)細(xì)胞的聚集。膠質(zhì)細(xì)胞的激活會誘發(fā)一系列炎性反應(yīng),導(dǎo)致脊髓處于一種敏化狀態(tài),這可能是導(dǎo)致疼痛慢性化的重要機(jī)制之一。5.老化過程中脊髓后索及背角中HMGB1及其受體RAGE表達(dá)大量增加,這可能是導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞活化的重要分子機(jī)制。6.老齡動物外周皮膚神經(jīng)纖維終末(PGP9.5)和熱傷害性感受器(TRPV1)數(shù)量減少;在背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)生長因子受體(TrkA)、熱傷害性感受器標(biāo)記物(TRPV1)的表達(dá)也發(fā)生了顯著下降。這可能是老齡時期感覺減退的原因之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R744

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本文編號：2489047