【摘要】：腦卒中是一類具有高發(fā)病率，高死亡率和高致殘率的疾病，已經(jīng)成為全球危害人類健康的主要疾病之一。缺血再灌注損傷是誘發(fā)腦卒中的重要病理生理過(guò)程，其具體機(jī)制十分復(fù)雜，主要涉及到興奮性氨基酸神經(jīng)毒性、Ca2+超載、自由基生成增多、能量代謝障礙和炎癥反應(yīng)等。活性氧自由基(Reactive Oxygen Species, ROS)生成增多被認(rèn)為是腦缺血再灌注損傷病理過(guò)程的核心環(huán)節(jié)。然而，線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝和活性氧自由基的主要生成場(chǎng)所，在缺血再灌注應(yīng)激條件下對(duì)細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞死亡有著十分重要的調(diào)節(jié)作用。腦缺血再灌注時(shí)氧自由基迅速增多導(dǎo)致線粒體酶活性、蛋白及膜類結(jié)構(gòu)功能遭到破壞，引起氧化磷酸化功能和酶活性進(jìn)一步降低，形成惡性循環(huán)。腦細(xì)胞線粒體功能紊亂與ROS生成增多可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）缺血性再灌注氧化損傷發(fā)生與發(fā)展的主要誘因之一。 金屬硫蛋白（metallothionein, MT），是一種廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中且具有清除氧自由基功能的小分子蛋白。金屬離子以及藥物毒性、缺血應(yīng)激等因素可以誘導(dǎo)CNS中MT-I/II（metallothionein-I/II, MT-I/II）表達(dá)明顯上調(diào)，在調(diào)節(jié)金屬離子穩(wěn)態(tài)、重金屬解毒、清除氧自由基、抗細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。缺血狀態(tài)下，MT-I/II可以通過(guò)清除ROS抗氧化應(yīng)激來(lái)保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。近年來(lái)研究提示，MTs作為一種多功能蛋白與線粒體功能調(diào)節(jié)具有密切聯(lián)系，在維持線粒體功能、促進(jìn)線粒體生成和損傷修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用。鑒于MT具有多功能的特性，，在缺血應(yīng)激條件下對(duì)腦組織氧化損傷的病理過(guò)程具有重要影響及其與線粒體功能調(diào)節(jié)具有密切聯(lián)系，本課題擬通過(guò)研究MT-I/II對(duì)腦缺血再灌注氧化損傷的作用及其參與線粒體功能的調(diào)節(jié)，闡明MT-I/II在腦缺血再灌注應(yīng)激條件下對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用并探討其可能機(jī)制。我們假設(shè)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中MT-I/II通過(guò)抑制氧化應(yīng)激，促進(jìn)線粒體生成和損傷修復(fù)來(lái)保護(hù)腦缺血再灌注損傷。 采用改良Longa線栓法分別對(duì)MT-I/II基因敲除C57BL/OLA129小鼠（MT-/-）和野生型小鼠（MT+/+）進(jìn)行大腦中動(dòng)脈阻塞術(shù)（Middle cerebralartery occlusion, MCAO），缺血2h后拔線栓恢復(fù)血流再灌注22h，建立小鼠腦缺血再灌注損傷模型。術(shù)后小鼠神經(jīng)功能發(fā)生明顯障礙，TTC染色結(jié)果顯示腦組織出現(xiàn)缺血病灶區(qū)，表明成功建立了小鼠腦缺血再灌注損傷模型。采用實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）檢測(cè)結(jié)果顯示小鼠腦缺血再灌注可以誘導(dǎo)腦組織MT-I和MT-II的mRNA表達(dá)呈逐漸增高的趨勢(shì)；同樣，western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示MT-I/II蛋白表達(dá)水平也呈逐漸增高的趨勢(shì)。對(duì)小鼠術(shù)后神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，其結(jié)果顯示兩種小鼠的神經(jīng)功能障礙評(píng)分未出現(xiàn)顯著差異性。采用TTC染色評(píng)價(jià)兩種小鼠術(shù)后的缺血面積，結(jié)果顯示MT-/-小鼠腦缺血面積明顯高于MT+/+小鼠；HE染色觀察發(fā)現(xiàn)MT+/+和MT-/-小鼠腦組織均出現(xiàn)空泡狀、細(xì)胞溶解壞死及細(xì)胞核固縮等現(xiàn)象，且MT-/-比MT+/+小鼠更為嚴(yán)重；TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示腦缺血再灌注后腦細(xì)胞凋亡明顯增加，且MT-/-的凋亡率明顯高于MT+/+小鼠。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后腦組織中MDA和蛋白羰基化含量明顯增高，且MT-/-明顯高于MT+/+小鼠（P0.05）；此外，缺血再灌注后MT-/-小鼠腦組織中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性發(fā)生明顯下降，而MT+/+小鼠腦組織SOD活性反而出現(xiàn)升高。對(duì)還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（Oxidized Glutathione，GSSG)檢測(cè)結(jié)果顯示MT+/+和MT-/-小鼠缺血再灌注后GSH含量和GSH/GSSG均明顯降低，且MT-/-小鼠下降程度較MT+/+小鼠明顯。對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)因子procaspaes-3的表達(dá)水平觀察發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后procaspase-3蛋白表達(dá)明顯下降，且MT-/-小鼠要明顯低于MT+/+小鼠。為了探索MT-I/II與線粒體功能的關(guān)系，采用western blotting檢測(cè)缺血再灌注后腦組織中過(guò)氧化物增殖激活受體γ協(xié)同激活因子(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γCoactivator1-α, PGC1-α)、解偶聯(lián)蛋白2（Uncoupling protein2，UCP2）及2型超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase-2，SOD2）的表達(dá)變化，其結(jié)果顯示缺血再灌注應(yīng)激可以引起PGC1-α和UCP2表達(dá)水平明顯增加，且MT+/+小鼠明顯高于MT-/-小鼠；而MT+/+小鼠缺血再灌注后腦組織中SOD2表達(dá)水平增加，MT-/-小鼠的SOD2表達(dá)水平降低。 結(jié)論：腦缺血再灌注導(dǎo)致腦組織結(jié)構(gòu)功能發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷和細(xì)胞凋亡，且MT-I/II表達(dá)缺失可以明顯加重其損傷，提示MT-I/II對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。其機(jī)制一方面可能是MT-I/II通過(guò)抑制氧化應(yīng)激的作用來(lái)保護(hù)腦細(xì)胞損傷；另一方面MT-I/II通過(guò)參與對(duì)線粒體功能的調(diào)節(jié)，促進(jìn)線粒體生成，抑制細(xì)胞凋亡的作用保護(hù)腦缺血再灌注引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。
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【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 朱耀民;袁祖貽;劉翔;景桂霞;;金屬硫蛋白對(duì)羅哌卡因灌注下離體兔心肌細(xì)胞凋亡和心肌細(xì)胞能供的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年08期

2 劉學(xué)忠,崔旭,王捍東,王宗元;金屬硫蛋白在大鼠全腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2004年01期

3 李崢;董志;;金屬硫蛋白對(duì)全腦缺血再灌注后損傷神經(jīng)的修復(fù)作用[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年02期

本文編號(hào)：2457609