【摘要】：目的本研究選擇生長分化因子 11(Growth differentiation factor 11,GDF11)與 C-C型趨化因子配體11(C-Cmotifchemokineligand11,CCL11)兩個蛋白進行研究,首先對文獻中報道的RD公司GDF11抗體的特異性進行檢測;然后檢測正常獻血者血漿中GDF11和CCL11的含量,分析人血液中GDF11和CCL11水平與年齡、性別、血型等的相關(guān)性;利用HT22和C17.2小鼠神經(jīng)細胞,明確GDF11對神經(jīng)干細胞凋亡、壞死、遷移、增殖、分化等的作用,研究GDF11發(fā)揮作用的信號通路,初步闡述其作用機制,探討GDF11在年齡相關(guān)的認知功能減退中潛在的應用價值,為后續(xù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究奠定理論基礎。方法1.采用SDS-PAGE及Western blot方法檢測RD公司GDF11抗體是否具有特異性。2.收集約300例不同年齡、性別、血型的正常獻漿人群的單人份新鮮冰凍血漿,-80℃凍存,待用,避免反復凍融。采用ELISA方法檢測血漿中GDF11、CCL11的含量,明確人血液中GDF11與CCL11的含量與年齡、性別、血型等的相關(guān)性。3.用完全培養(yǎng)基(含5%馬血清、10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基)將小鼠海馬神經(jīng)細胞系HT22或神經(jīng)干細胞系C17.2在37℃和5%(CO2條件下培養(yǎng)過夜后,更換為饑餓培養(yǎng)基(含1%胎牛血清和0.5%馬血清的高糖DMEM)繼續(xù)培養(yǎng)6h,然后①HT22細胞實驗組:棄去原有培養(yǎng)基,加入含有不同濃度GDF11(12.5、25、50、100ng/mL)的饑餓培養(yǎng)基培養(yǎng);C17.2細胞實驗組:分別加100ng/mLNGF,1OOng/mLGDF11,25ng/mLGDF11。②對照組:棄去原有培養(yǎng)基,加入與實驗組相同體積的饑餓培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)6h,24h,36h或48h后,分別進行如下實驗。4.GDF11處理96孔板中的HT22和C17.2細胞24h或48h后,倒置熒光顯微鏡觀察GDF11對細胞形態(tài)的影響,通過Hoechst和PI雙染法測定細胞凋亡和壞死情況,采用增強型CCK8法檢測細胞活力及增殖情況。5.對24孔板中的HT22細胞進行人為劃痕損傷實驗,觀察損傷后不同濃度GDF11(12.5,25,50,100ng/mL)對細胞向劃痕處遷移能力的影響。6.通過實時定量PCR(qRT-PCR)檢測GDF11刺激12孔板中的HT22和C17.2細胞6h后細胞周期蛋白CyclingD2、神經(jīng)干細胞標志蛋白nestin、神經(jīng)元標志蛋白βⅢ-Tubulin、星形膠質(zhì)細胞標志蛋白GFAP及信號通路蛋白EGFR、Notch1等的mRNA表達情況。7.利用Western blot方法分析GDF11刺激6孔板中的HT22細胞后對TGF-β信號通路中的Smad2/3以及cAMP應答元件結(jié)合蛋白Creb等蛋白的磷酸化的影響。8.統(tǒng)計學分析:采用GraphPad Prism 5軟件進行圖表繪畫及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。Western blot條帶采用Image J軟件進行灰度分析。目的條帶灰度值經(jīng)對應的內(nèi)參調(diào)整后,計算磷酸化蛋白與總蛋白的比值,同時將正常對照組磷酸化蛋白/總蛋白的比值設定為1,然后進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析,雙組間的比較采用配對t檢驗。當P0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果1.Western blot結(jié)果顯示:RD公司的GDF11單克隆抗體可結(jié)合GDF8,但與IgG單鏈不具有交叉反應。2.ELISA結(jié)果顯示:人血漿中GDF11水平隨年齡增加呈遞減趨勢,CCL11含量則隨年齡的增加而增加,并且在男性中顯著高于女性(P0.01),但血型間并無差異。3.Hoechst和PI雙染結(jié)果顯示:GDF11對HT22細胞凋亡、壞死無影響。4.增強型CCK8檢測結(jié)果顯示:不同濃度GDF11處理海馬神經(jīng)細胞系HT22和神經(jīng)干細胞系C17.2 48h后,均表現(xiàn)出細胞活力增強,且有顯著性差異(P0.01),但并無劑量依賴。5.劃痕損傷實驗結(jié)果:GDF11處理組遷移至劃痕損傷處的細胞數(shù)量相對對照組較少。6.qRT-PCR結(jié)果顯示:與對照組相比,不同濃度GDF11處理細胞6h后,神經(jīng)元標志物βⅢ-TubulinmRNA表達水平明顯增加(P0.01,n=3),但沒有劑量依賴性;細胞干性標志物Nestin表達有所下降,星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP有所增加,但無統(tǒng)計學差異;細胞周期標志物CyclinD2表達下調(diào)(P0.05,n=3),但沒有劑量依賴性;EGFR、Notch1表達下降,有顯著性差異(P0.05),且有劑量依賴性,表明GDF11可能通過抑制EGFR和Notch等信號通路對神經(jīng)干細胞的增殖分化進行調(diào)控。7.Western blot結(jié)果顯示:GDF11組(處理24h)與對照組相比,Smad2/3和Creb蛋白表達無明顯變化,p-Smad2/3、p-Creb蛋白表達均顯著增加,但無顯著的劑量依賴性,表明不同濃度的GDF11均可激活Smad2/3和Creb的磷酸化,可能通過啟動TGF-β/Smad2/3、Creb等信號通路對小鼠海馬神經(jīng)細胞的增殖分化進行調(diào)控。結(jié)論1.文獻報道中的RD公司的GDF11單克隆抗體不能辨別GDF11和GDF8,但也不會結(jié)合IgG輕鏈。2.人血漿中GDF11含量隨年齡增加有遞減趨勢,CCL11含量隨年齡增加而增加,且在相同年齡的前提下男性血漿中含量高于女性,血型之間無差異。3.GDF11可能通過抑制Notch、EGFR信號通路,激活TGF-β、Creb信號通路等抑制HT22細胞的遷移,促進HT22、C17.2細胞的增殖與分化。
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【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R741

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王靜;何麗杰;鄧為民;;血清CCL11水平對結(jié)腸癌患者預后的影響[J];醫(yī)學與哲學(B);2016年05期

2 趙洪偉;魏智宇;候春梅;孫亮;許鳳燕;孫琪;吳樹亮;;年輕血液對衰老相關(guān)認知功能障礙的改善作用[J];解剖科學進展;2015年01期

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本文編號：2450075