【摘要】：第一部分血流動力學誘導兔基底動脈平滑肌細胞表達譜變化的基因芯片研究目的:顱內(nèi)動脈瘤是一種嚴重威脅人類健康的疾病,動脈瘤一旦破裂,致殘致死率較高。目前對于顱內(nèi)動脈瘤的治療主要有開顱手術(shù)與血管內(nèi)治療。隨著技術(shù)的進步,盡管治療的安全性越來越高,但是仍存在手術(shù)的風險。因此,探索動脈瘤的無創(chuàng)治療成為一種新的思路。要尋找無創(chuàng)治療的靶點就要求我們對動脈瘤的病因?qū)W開展研究。目前關(guān)于動脈瘤發(fā)生發(fā)展的主流研究觀點認為,血流動力學因素在其中有重要作用。關(guān)于兔顱內(nèi)動脈瘤模型的文獻報道,結(jié)扎兔雙側(cè)頸總動脈后,基底動脈在高血流負荷條件下發(fā)生了顯著重構(gòu),但其中主要的細胞成分平滑肌細胞(smooth muscle cells,SMCs)發(fā)生了怎樣的改變并不清楚。本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù),對基底動脈SMCs在血管重構(gòu)過程中基因表達譜進行研究,探討血管在血流負荷下重構(gòu)的生物學過程,分析表達差異的基因,為下一步的研究提供線索。方法:新西蘭大白兔,隨機分為實驗組和對照組。實驗組結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈,對照組暴露雙側(cè)頸總動脈。5天后將新西蘭大白兔處死,應(yīng)用生理鹽水予以心臟灌注,開顱取基底動脈標本。應(yīng)用酶消化法,分離基底動脈SMCs。將平滑肌樣品抽提總RNA后,應(yīng)用Agilent rabbit 4×44K芯片進行檢測。然后選取部分基因應(yīng)用Real-time PCR對芯片結(jié)果的可信性進行驗證。最后對所得差異基因進行GO(Gene Ontology)分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。并對差異基因中包含的轉(zhuǎn)錄子進行分析。結(jié)果:結(jié)扎兔雙側(cè)頸總動脈5天后可見兔基底動脈發(fā)生顯著重構(gòu),基底動脈迂曲,直徑增大。芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)947個差異基因,其中實驗組與對照組相比,617個基因表達升高,330個基因表達降低。選取了PTHLH、ENPP1、IGF1等芯片結(jié)果提示發(fā)生改變的基因進行了PCR的驗證,結(jié)果顯示所有選取的基因在RNA水平上改變的趨勢與芯片的結(jié)果是一致的,這也證明了芯片結(jié)果的可靠性。對差異基因進行GO分析顯示,在血流動力學改變誘導兔基底動脈重構(gòu)的過程中,差異基因主要參與細胞之間的信號傳遞和細胞的發(fā)育過程;參與組成細胞內(nèi)成分、細胞膜連接的細胞器;參與蛋白的結(jié)合等功能。KEGG通路分析結(jié)果顯示,血流動力學誘導血管重構(gòu)時,表達下調(diào)的基因主要與精氨酸和脯氨酸代謝相關(guān);表達上調(diào)的基因主要與細胞外受體之間的相互作用、局部的粘附等相關(guān)。另外,我們發(fā)現(xiàn)血流動力學負荷誘導發(fā)生顯著改變的基因中,包含25個轉(zhuǎn)錄因子,它們可能參與調(diào)控基因的表達。結(jié)論:兔基底動脈平滑肌細胞在高血流負荷條件下,其基因表達發(fā)生了顯著變化。通過數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)了一些特定基因及轉(zhuǎn)錄因子可能在血流動力學誘導的血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。第二部分EGFR在血流動力學誘導大鼠顱內(nèi)動脈瘤生成中的作用及機制研究目的:本課題擬研究表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)對血流動力學改變誘導大鼠顱內(nèi)動脈瘤生成的影響,并探討EGFR對動脈瘤生成中的作用機制。方法:SD大鼠隨機分為4組:空白對照組、動脈瘤組、Erlotinib組(EGFR抑制劑組)、Erlotinib溶劑組。動脈瘤組、Erlotinib組及Erlotinib溶劑組大鼠,均予以結(jié)扎左側(cè)頸外動脈、左側(cè)翼顎動脈及右側(cè)頸總動脈,建立血流動力學改變誘導大鼠顱內(nèi)動脈瘤模型。對照組予以暴露上述血管,但不進行結(jié)扎。2周后取空白對照組及動脈瘤組大鼠的顱內(nèi)動脈,對EGFR及EGFR的激活形式磷酸化EGFR(EGFR-P)進行Western blot檢測。建模3個月后應(yīng)用血管鑄型劑(Batson’s#17),對大鼠進行心臟灌注,獲取顱內(nèi)動脈血管鑄型,并進行掃描電子顯微鏡觀察,對各組成瘤率進行統(tǒng)計分析。于3個月時,應(yīng)用生理鹽水對大鼠進行心臟灌注,獲取大鼠顱內(nèi)血管后提取RNA,并應(yīng)用PCR對MMP2、MMP9等動脈瘤標記物進行檢測。同時建模3個月后應(yīng)用生理鹽水及多聚甲醛對大鼠進行心臟灌注,獲取大鼠大腦組織,予以包埋、切片,并進行HE染色、免疫組化和EVG染色等檢測。結(jié)果:建立動脈瘤模型2周后,動脈瘤組與對照組腦血管EGFR及EGFR-P的Western blot檢測結(jié)果顯示,EGFR表達在動脈瘤組與對照組之間無明顯差異,EGFR-P在動脈瘤組表達較對照組升高。各組大鼠腦血管鑄型結(jié)果顯示:3個月時,動脈瘤組在大鼠前交通部位有明顯動脈瘤形成。Erlotinib組,動脈瘤的成瘤率較動脈瘤組低。各組血管標本的HE及EVG染色結(jié)果顯示:動脈瘤組較對照組,血管發(fā)生了顯著重構(gòu),血管內(nèi)膜褶皺較對照組明顯,血管壁較對照組增厚。Erlotinib組血管重構(gòu)較動脈瘤組明顯減輕。免疫組化結(jié)果顯示:動脈瘤組較空白對照組,MMP2、MMP9表達明顯升高。而Erlotinib組MMP2、MMP9表達較動脈瘤組降低。Real-time PCR結(jié)果同樣顯示:動脈瘤組MMP2、MMP9表達較空白對照組升高,Erlotinib組表達較動脈瘤組降低。結(jié)論:在血流動力學改變誘導大鼠顱內(nèi)動脈瘤模型中,EGFR通路被激活。應(yīng)用Erlotinib阻斷EGFR可以減輕血流動力學誘導大鼠顱內(nèi)動脈瘤的生成,其機制可能是通過抑制MMP2和MMP9的表達,進而減輕血管的重構(gòu)發(fā)揮作用的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743

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本文編號：2422188