【摘要】：膠質(zhì)瘤是臨床上最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤,其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是最常見、惡性程度最高的膠質(zhì)瘤。雖然在過(guò)去幾年膠質(zhì)瘤的研究取得了很大進(jìn)步,但惡性膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后仍然很差。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種多基因和多信號(hào)通路異常的疾病,目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制仍不是很清楚。 近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),亮氨酰-tRNA合成酶(leucyl-tRNA synthetase, LARS)除其催化亮氨酰-tRNA合成的經(jīng)典功能外,還具有非經(jīng)典功能,是腫瘤相關(guān)基因。但LARS在膠質(zhì)瘤中的研究鮮有報(bào)道。MicroRNAs(miRs)是一類小的非編碼RNA,負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)。研究表明miRs在多種腫瘤(包括膠質(zhì)瘤)中異常表達(dá),扮演癌基因或抑癌基因的作用。目前尚不清楚LARS是否與miRs存在關(guān)系。 本課題研究的主要目的是探討LARS基因在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及miR-451與LARS基因表達(dá)關(guān)系,為揭開膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制、開拓新的治療策略和靶點(diǎn)提供線索。 第一部分應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR (real-time PCR)和蛋白印跡法(western blot)檢測(cè)了9個(gè)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和1例正常腦組織的LARS表達(dá)量,結(jié)果顯不LARS在9個(gè)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和1例正常腦組織均有表達(dá)且在9個(gè)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)量明顯高于正常腦組織(P＜0.05), PCR和western blot結(jié)果相一致。又運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)了LARS在含有75例膠質(zhì)瘤和5例瘤旁正常腦組織的組織芯片中的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)LARS在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)要明顯高于在正常腦組織中的表達(dá)(P0.05),與膠質(zhì)瘤級(jí)別成正相關(guān),但相關(guān)程度不高(r=0.283,P0.05),且I/II級(jí)和III/IV級(jí)膠質(zhì)瘤之間LARS表達(dá)差異不明顯(P0.05)。由此,我們得出結(jié)論LARS在人腦膠質(zhì)瘤中過(guò)表達(dá),可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展。 第二部分利用LARS小干擾RNA (LARS siR)技術(shù)探討了敲低LARS表達(dá)對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和SNB19生物學(xué)行為的影響及可能的機(jī)制。首先,利用real-time PCR和western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了轉(zhuǎn)染LARS siR后LARS基因的表達(dá)變化,結(jié)果顯示LARS siR可以有效敲低LARS表達(dá)。緊接著敲低LARS表達(dá)后,利用MTT法分析了細(xì)胞增殖活性,細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分析了細(xì)胞群體依賴性和增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)分析了細(xì)胞周期分布,劃痕、transwell實(shí)驗(yàn)分析了細(xì)胞遷移侵襲能力,annexin-V法檢測(cè)了細(xì)胞凋亡率,western blot分析相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明敲低LARS表達(dá)抑制了惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力,阻滯細(xì)胞周期在G0/G1期,降低了細(xì)胞遷移侵襲能力,下調(diào)了哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex1, mTORC1)信號(hào)通路的活性,但對(duì)細(xì)胞凋亡沒有明顯的影響。由此,我們得出結(jié)論LARS基因可能在膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過(guò)mTORC1信號(hào)通路扮演癌基因的作用,有望成為治療膠質(zhì)瘤的一個(gè)新的基因靶點(diǎn)。 第三部分利用人工合成寡核苷酸miR-451mimics和miR-451inhibitor探討了miR-451與LARS的靶向調(diào)控關(guān)系。結(jié)果顯示miR-451mimics和inhibitor可以有效上調(diào)和下調(diào)miR-451在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),且與LARS蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。構(gòu)建LARS3'-UTR雙熒光素酶質(zhì)粒,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了miR-451調(diào)控LARS表達(dá)的機(jī)制：LARS是miR-451的直接靶基因。由此,我們得出結(jié)論LARS在膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)受miR-451表達(dá)的調(diào)控。 綜上所述,LARS基因除了其負(fù)責(zé)催化亮氨酰-tRNA合成的經(jīng)典功能外,在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中尚且起到癌基因的作用,且受到miR-451表達(dá)的影響,可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用,為膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供了新線索,有望成為新的治療靶點(diǎn),值得深入探討。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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1 浦佩玉;腦膠質(zhì)瘤分子生物學(xué)與分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J];中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué);2001年04期

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本文編號(hào)：2419674