【摘要】：腦血管病(cerebral vascular diseases,CVD)是一種常見的高致殘致死率的臨床疾病,其中腦梗死最為多見。目前,治療腦梗死除了溶栓和抗血小板治療外,尚沒有更為有效的治療措施。但由于溶栓治療的嚴格時間窗限制及存在腦出血的風險,溶栓治療并非腦梗死的常規(guī)治療方法。因此,臨床上大部分的腦缺血治療方案為對癥保守治療,效果難以令人滿意。干細胞是一類具有自我更新能力、高度未分化性和多向分化潛能的細胞,越來越多的證據(jù)表明,干細胞移植有望成為治療腦血管病有前途的細胞替代性治療策略,干細胞技術(shù)的發(fā)展,為治療甚至治愈腦梗死提供了可能。多種干細胞如胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)和神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs)及骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)已經(jīng)應用于腦梗死的替代治療。脂肪干細胞(adipose.derived stem cells, ADSCs)由于取材容易,避免其他來源干細胞細胞移植中存在的倫理、免疫排斥、來源有限等問題,是很好的種子來源,近年來已應用治療腦梗死的研究中。干細胞移植治療首先要解決如何示蹤移植細胞的存活、遷移、定居、分化情況。MRI技術(shù)具有分辨率高、無侵襲件和高臨床應用率等優(yōu)點,能夠很好顯示經(jīng)特定MRI對比劑標記的移植干細胞的分布、增殖及遷移等情況。選擇合適的對比劑來標記干細胞,是進行移植干細胞磁共振活體示蹤成像成功與否的關(guān)鍵。超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide, SPIO)微粒是一種MRI負性對比劑,標記移植細胞(細胞內(nèi)標記或者細胞表面標記)能顯著降低MRI下的T2WI和T2*WI信號,明顯區(qū)分移植細胞和原位組織細胞,從而間接反映移植細胞的分布和遷移情況。以往廣泛應用于臨床的SPIO相繼退市,極大地阻礙了干細胞活體示蹤技術(shù)的發(fā)展。Ferumoxytol是一種新型SPIO,目前已獲FDA批準進入臨床,用于治療成人慢性腎病所致的缺鐵性貧血。本實驗用Ferumoxytol體外標記hADSCs,在磁共振下體內(nèi)外觀察標記的hADSCs,監(jiān)測hADSCs在腦內(nèi)存活、增殖和遷移情況,分析對MCAO大鼠的神經(jīng)功能評分改變的影響,評價Ferumoxytol標記1ADSCs經(jīng)立體定向移植治療大鼠腦梗死的可行性。第一部分人脂肪來源干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定目的：探索人脂肪來源干細胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs) 的體外培養(yǎng)方法。方法：取脂肪抽吸術(shù)獲得的脂肪抽吸物分離獲得hADSCs,貼壁法擴增培養(yǎng)hADSCs,相差顯微鏡觀察原代及不同傳代細胞的生長形態(tài)變化,并進行細胞活力、增殖能力、細胞表型鑒定及多向分化潛能檢測。結(jié)果：培養(yǎng)的BMSCs傳代24小時后已有部分細胞貼壁,第7天細胞已達90%融合，至第3代可得純化的hADSCs;細胞表面抗原CD13、CD44、CD90呈高表達,低表達CD34、CD45、CD 106; hADSCs在功能上具有成脂肪、成骨及成軟骨潛能。結(jié)論：第3代hADSCs可作為理想細胞移植治療的細胞來源。第二部分Ferumoxytol標記hADSCs及其生物學影響目的：明確新型超小超順磁性氧化鐵納米微粒(USPIO) Ferumoxytol體外標記hADSCs所需的合適濃度和鐵微粒在細胞中的代謝、存留情況,探討Ferumoxytol標記hADSCs的可行性,為標記細胞的磁共振成像奠定基礎。方法：首先從ferumoxytol-魚精蛋白(ferumoxytol-protamine, PF)、ferumoxytol-肝素-魚精蛋白(ferumoxytol-heparin-protamine,HPF)以及ferumoxytol-多聚賴氨酸(ferumoxytol-poly-L-lysine, F-PLL)復合物中選取最合適的標記物,并選定適合濃度；然后,對標記后]ADSCs的形態(tài)學、活力、表面抗原、增殖能力、凋亡和多向分化能力進行檢測。結(jié)果：HPF對的hADSCs標記效果最佳；含鐵量為50μg/ml的HPF標記hADSCs對細胞的生物學特性無影響。結(jié)論：最佳濃度HPF標記對hADSCs的生物學活性沒有影響,可用于體內(nèi)動物實驗。第三部分Ferumoxytol標記hADSCs的體內(nèi)外MR成像研究目的：應用MR成像技術(shù)觀察Ferumoxytol標記后的hADSCs體外成像情況,并移植入正常SD大鼠腦內(nèi),初步評價MRI體內(nèi)示蹤Ferumoxytol標記hADSCs的可行性及探討最佳的掃描方法。方法：對Ferumoxytol標記hADSCs進行離體試管及移植入正常大鼠腦內(nèi)的MRI觀察。結(jié)果：離體試管MRI各序列顯示標記細胞不同程度的信號降低,其中ESWAN序列信號減低最明顯；標記細胞移植入正常大鼠腦內(nèi)后28天仍可在ESWAN序列上.顯示為局部低信號。結(jié)論：MR成像技術(shù)能夠?qū)w外及活體移植的Ferumoxytol標記hADSCs進行活體示蹤,以ESWAN序列最敏.感；標記hADSCs移植入正常大鼠腦內(nèi),28d內(nèi)停留于注射位點,未見遷移。第四部分MCAO大鼠模型的建立目的：用線栓法制作SD大鼠大腦中動脈梗塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型,掌握模型制作方法。方法：選用健康、成年雄性清潔級SD大鼠,用線栓法堵塞大腦中動脈1.5h,再灌注后1 d Zea-Longa評分2-3分為成功模型。模型制造后1d、7d、14d、28d通過神經(jīng)功能缺損嚴重程度評分(modified Neurological Severity Scores, mNSS)評分觀察其行為學改變,同時行MRI檢查了解各序列梗塞病灶變化情況,再灌注后28d斷頭取腦,進行HE染色觀察梗塞情況。結(jié)果：技術(shù)未成熟時模型制備再灌注24小時內(nèi)模型成功率為55%。各時間點NSS評分有明顯差異,手術(shù)后NSS有所改善。成功模型MRI掃描可見大鼠梗死區(qū)腦組織T2WI示顯著高信號。結(jié)論：技術(shù)成熟后,線栓法可制備穩(wěn)定的MCAO大鼠模型,能作為腦梗死實驗研究的模型。第五部分Ferumoxytol標記hADSCs移植治療MCAO大鼠的MR活體示蹤目的：干細胞移植入MCAO大鼠腦內(nèi)后,使用MRI活體監(jiān)測移植干細胞的存活、分布及遷移。方法：線栓法制作MCAO模型,實驗動物共分5組：假手術(shù)組：僅分離結(jié)扎頸外動脈分支,不插入栓線；MCAO組：MCAO模型成功后不進行移植；PBS組：MCAO后同側(cè)紋狀體內(nèi)PBS液：未標記組：MCAO后移植未經(jīng)Ferumoxytol標記的hADSCs;磁標記組：MCAO后移植Ferumoxytol標記的hADSCs。移植成功后分別在1d、7d、14d、28d參照mNSS進行神經(jīng)功能缺損評分,GE 3.0T磁共振掃描儀動態(tài)觀察移植細胞的存活及遷移,將所得到的影像學檢查結(jié)果與腦組織切片的HE染色及普魯士藍染色進行對照研究。結(jié)果：除移植后1天外,其余時間點未標記組和標記組大鼠的神經(jīng)功能缺損均較MCAO組評分差異有顯著性(P0.05)；磁共振檢查結(jié)果顯示移植后1天呈邊界清晰的團塊狀類圓形低信號,隨著時間的推移,T1WI移植位點低信號微弱,T2WI可見移植位點的低信號邊界略顯模糊,而在ESWAN序列仍清晰；磁標記組28天腦缺血邊緣區(qū)(移植位點周圍)可見大量、缺血灶內(nèi)可見散在、同側(cè)蛛網(wǎng)膜下腔可見零星少量藍染細胞。結(jié)論：Ferumoxytol標記的hADSCs移植入缺血性腦梗死大鼠腦內(nèi)后,磁共振成像在長達28天的活體監(jiān)測過程中,均可明確顯示移植干細胞的分布情況。
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【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

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1 殷雁;人脂肪來源干細胞的Ferumoxytol標記及移植治療大鼠腦梗死的磁共振成像研究[D];大連醫(yī)科大學;2014年

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本文編號：2405134