發(fā)布時(shí)間：2018-12-15 20:49

【摘要】：背景 帕金森�。≒arkinson's disease, PD）是目前發(fā)病率僅次于阿茲海默病的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理特點(diǎn)是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的死亡以及路易氏體形成。然而對(duì)于帕金森病的發(fā)病機(jī)制目前仍然不清楚，目前的研究認(rèn)為其與年齡因素、遺傳因素和神經(jīng)毒物等因素有關(guān)。我國(guó)目前大概有180多萬(wàn)人患有這種疾病，并且伴隨著我國(guó)社會(huì)老齡化，估計(jì)在未來(lái)25年帕金森病的發(fā)病率將會(huì)翻倍。因此，帕金森病已經(jīng)成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病領(lǐng)域亟需解決的重大難題。 黑質(zhì)致密部多巴胺能(SNc DA)神經(jīng)元是基底神經(jīng)節(jié)的重要的組成部分。另外，在近期的研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元易于受損，而與其相鄰的腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺能神經(jīng)元所受的影響相對(duì)較小。并且有學(xué)者發(fā)現(xiàn)使用特異性L型鈣通道拮抗劑可以對(duì)抗環(huán)境毒物引起的黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元缺失。因此，我們可以推測(cè)離子通道的分布與神經(jīng)元放電模式的變化在帕金森病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，發(fā)揮著重要作用。國(guó)內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道鈣離子通道參與帕金森病發(fā)病過(guò)程，主要可能與鈣超載誘發(fā)的線粒體功能障礙有關(guān)，但其具體機(jī)制目前尚未完全闡明。 黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元有著特殊的生理特點(diǎn)，大多數(shù)的多巴胺能神經(jīng)元有著自發(fā)的放電，放電規(guī)整，呈“鐘擺樣”，頻率為2-4Hz。其細(xì)胞膜上分布著大量在較低電位激活的鈣離子通道，在生理?xiàng)l件下，對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的代謝壓力。但是在神經(jīng)毒物誘發(fā)的氧化應(yīng)激條件下，多巴胺能神經(jīng)元的膜屬性及放電模式的變化目前還沒(méi)有明確的機(jī)制研究。 腦片培養(yǎng)技術(shù)是一個(gè)研究神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的良好平臺(tái)，具有很多優(yōu)勢(shì)。培養(yǎng)的腦組織片保留了完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和局部的功能突觸聯(lián)系環(huán)路，具有良好狀態(tài)的神經(jīng)功能活動(dòng)。并且腦片培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)有著易于控制處理?xiàng)l件和便于觀察的優(yōu)勢(shì)，為使用制作帕金森病的體外環(huán)境模擬提供了很好的平臺(tái)。 目的 本課題旨在研究6-羥基多巴胺（6-OHDA）對(duì)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元電生理屬性的調(diào)節(jié)作用。在6-OHDA引起的氧化應(yīng)激條件下，觀察研究SNc DA神經(jīng)元興奮性和放電模式的變化，并將它們與電壓依賴性鈣離子通道和小電導(dǎo)鈣激活的鉀離子通道聯(lián)系起來(lái)。進(jìn)一步在腦片培養(yǎng)模型中分析在放電模式轉(zhuǎn)變中SK通道的作用及機(jī)制；以及將電生理方法和細(xì)胞生物學(xué)方法結(jié)合，探究小電導(dǎo)鈣激活的鉀離子通道（SK通道）在6-OHDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡中的保護(hù)作用，為帕金森病的預(yù)防和治療提供新思路和策略。 方法 在實(shí)驗(yàn)中，我們使用急性分離腦片和腦片培養(yǎng)兩種模型來(lái)研究神經(jīng)毒物6-OHDA對(duì)SNc DA神經(jīng)元的作用。在短期和較長(zhǎng)時(shí)間6-OHDA處理情況下，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞興奮性，神經(jīng)元放電模式及動(dòng)作電位速率變化。進(jìn)一步的，我們觀察了6-OHDA對(duì)電壓依賴性鈣離子通道與小電導(dǎo)鈣激活的鉀離子通道的作用。本課題分為兩個(gè)部分： 首先，在大鼠急性分離的腦片使用膜片鉗全細(xì)胞記錄,觀察急性6-OHDA（0.5mM）作用對(duì)黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元放電模式和放電頻率的變化，主要是對(duì)峰峰間期柱狀圖和放電頻率變異系數(shù)進(jìn)行了分析。在電壓鉗模式下，測(cè)量了電壓依賴性鈣通道電流，，并使用特異性鈣離子拮抗劑分離了各亞型鈣離子通道電流。比較了6-OHDA組和對(duì)照組中SNc DA神經(jīng)元的鈣離子通道亞型電流的比例。使用短暫的去極化電壓誘導(dǎo)出后超極化電流。 其次，使用腦片培養(yǎng)技術(shù)建立了一個(gè)可以使用低劑量6-OHDA（25μM）長(zhǎng)時(shí)間處理多巴胺神經(jīng)元的腦片模型。利用乳酸脫氫酶（LDH）釋放試驗(yàn)評(píng)估腦片培養(yǎng)神經(jīng)元的活力；利用絡(luò)氨酸羥化酶(TH)免疫組化標(biāo)記多巴胺能神經(jīng)元，觀察神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)；結(jié)合膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)，通過(guò)自相關(guān)分析，探索SK通道在6-OHDA引起的放電模式變化中所發(fā)揮的作用；同時(shí)，使用TUNEL法檢測(cè)黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的損傷情況。 結(jié)果 1.6-OHDA對(duì)大鼠黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元電生理特性的影響 1.16-OHDA（0.5mM）對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的放電頻率有明顯抑制作用，且具有劑量依賴性。6-OHDA組的峰峰間期的變異率（CV=0.435±0.354）與對(duì)照組（CV=0.058±0.009）相比，明顯變大（P=0.037）。 1.2通過(guò)空間時(shí)域圖（phase plot）分析，發(fā)現(xiàn)6-OHDA減慢了DA能神經(jīng)元去極化過(guò)程中的速率。 1.3在6-OHDA（0.5mM）暴露下，電壓依賴性鈣通道電流增大，且N型鈣離子通道電流比例較control組增大（P=0.0404）。 1.46-OHDA（0.5mM）對(duì)mAHP的影響與SK通道激動(dòng)劑1-EBIO的效應(yīng)類似的，即mAHP的峰值電流與對(duì)照組相比增大至177.53±4.96pA(149.12±4.11%，P0.01) 2.在中腦黑質(zhì)腦片培養(yǎng)模型中，SK通道參與6-OHDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡 2.1中腦腦片培養(yǎng)模型多巴胺能神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)和電生理特點(diǎn)與急性分離的多巴胺能神經(jīng)元類似，表明腦片模型培養(yǎng)成功，且通過(guò)LDH釋放試驗(yàn)表明腦片組織的代謝水平穩(wěn)定。 2.218h6-OHDA（25μM）處理組的神經(jīng)元靜息膜電位較對(duì)照組明顯升高（p=0.023）。 2.36-OHDA（25μM）的處理降低了神經(jīng)元峰電位的軌道周徑，減慢了神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏娜O化和復(fù)極化的速率。 2.4在6-OHDA（25μM）暴露下，SK通道抑制劑Apamin可以誘發(fā)更頻繁的爆發(fā)性放電，而SK通道的激動(dòng)劑可以減少爆發(fā)性放電。 2.56-OHDA（25μM）可以增大Apamin敏感性SK電流67.13±8.45%（P 0.01），但當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)液加入EGTA（3mM或5mM）螯合胞內(nèi)鈣離子時(shí)，ImAHP明顯減小，且具有劑量依賴性。 2.6SK通道激動(dòng)劑1-EBIO可以對(duì)抗6-OHDA（25μM）誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，而Apamin會(huì)增加6-OHDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。 結(jié)論 規(guī)律的節(jié)律放電（pacemaking）是黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元的特征性表現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6-OHDA可以改變多巴胺能神經(jīng)元的放電模式，由規(guī)律的pacemaking模式變?yōu)榛祀s著爆發(fā)性放電的不規(guī)則放電模式。這種改變的主要原因之一是由于6-OHDA改變了電壓依賴性鈣離子通道和SK通道電流的大小。同時(shí)，在6-OHDA暴露下，使用SK通道激動(dòng)劑可以對(duì)抗其誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，證明了SK通道活性在氧化應(yīng)激條件下發(fā)揮著重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742.5

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本文編號(hào)：2381269