【摘要】：目的探究脂肪基質(zhì)細胞源性星形膠質(zhì)細胞是否具有真正成熟星形膠質(zhì)細胞的神經(jīng)營養(yǎng)和清除細胞外谷氨酸的功能。方法1從成人腹部皮下脂肪組織中提取ADSC并進行傳代培養(yǎng);待ADSC生長至第3代第5d時應(yīng)用DE-1誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化,得誘導(dǎo)48h、7d、14d和21d組細胞,第3代第5d細胞為未誘導(dǎo)組細胞。倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)學(xué)特征。2ADSC源性星形膠質(zhì)細胞的鑒定:使用免疫細胞化學(xué)法、免疫熒光染色法和Western blotting法檢測各組細胞的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達。3 ADSC源性星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)營養(yǎng)功能檢測:使用免疫細胞化學(xué)法、免疫熒光染色法和Western blotting檢測膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)的表達。4 ADSC源性星形膠質(zhì)細胞清除谷氨酸功能檢測:使用免疫細胞化學(xué)法、免疫熒光染色法和Western blotting檢測谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1(Glutamate transporter-1,GLT-1)和谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)的表達;MTT法分別檢測谷氨酸對細胞存活率的影響,從而確定“最適谷氨酸干預(yù)濃度”;“最適谷氨酸干預(yù)濃度”的谷氨酸干預(yù)各組細胞,谷氨酸濃度測定法檢測各組細胞對細胞外谷氨酸濃度的影響。6統(tǒng)計學(xué)分析:使用Excel 2003錄入實驗數(shù)據(jù)并用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計分析,以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1 ADSC原代培養(yǎng)24h時可見較多的長梭形、類圓形等形態(tài)的貼壁細胞,培養(yǎng)至第3代第5d時細胞呈長梭形、漩渦狀排列生長;誘導(dǎo)48h時細胞胞質(zhì)背向細胞核伸出少量較短的突起,誘導(dǎo)7d時其突起較誘導(dǎo)24h時增多、增長且部分突起交織成網(wǎng),誘導(dǎo)14d時細胞可見更多網(wǎng)狀交織的突起,誘導(dǎo)至21d時細胞突起較前變少、變短,偶可見突起斷裂現(xiàn)象。2 ADSC源性星形膠質(zhì)細胞鑒定結(jié)果:未誘導(dǎo)組未見GFAP陽性表達細胞,在各誘導(dǎo)組均可見GFAP陽性表達細胞,且其陽性表達部位廣泛分布于細胞胞質(zhì)和突起;GFAP的陽性表達率和表達水平均于誘導(dǎo)14d時達到高峰,且各組之間均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P均0.05)。3 ADSC源性星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)營養(yǎng)功能檢測結(jié)果:未誘導(dǎo)組未見GDNF陽性表達細胞,在各誘導(dǎo)組均可見GDNF陽性表達細胞,且其陽性表達部位廣泛分布于細胞胞質(zhì)和突起;GDNF的陽性表達率和表達水平均于誘導(dǎo)7d時達到高峰,且各組之間均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P均0.05)。4 ADSC源性星形膠質(zhì)細胞谷氨酸清除功能檢測結(jié)果:未誘導(dǎo)組未見GLT-1和GS陽性表達細胞及GFAP/GLT-1和GFAP/GS的共表達細胞,且其陽性表達部位廣泛分布于細胞胞質(zhì)和突起;以上細胞的陽性表達率和表達水平均于誘導(dǎo)14d時達到高峰,且各組之間均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P均0.05)。130μm/l對各組細胞的存活率均無影響;在誘導(dǎo)48h、7d和14d組,隨谷氨酸干預(yù)時間的延長,細胞外谷氨酸的濃度均逐漸降低(P均0.05);在未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)21d組,隨谷氨酸干預(yù)時間的延長,細胞外谷氨酸的濃度均無統(tǒng)計學(xué)差異(P均0.05);此外,誘導(dǎo)14d組細胞外谷氨酸濃度的下降趨勢最明顯。結(jié)論1 ADSC向星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)分化第7-14天時,細胞具有典型的成熟星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)特征。2 ADSC源性星形膠質(zhì)細胞表達神經(jīng)營養(yǎng)相關(guān)蛋白GDNF,且GDNF的表達于誘導(dǎo)分化反應(yīng)第7d時達到高峰。3 ADSC源性星形膠質(zhì)細胞表達谷氨酸清除相關(guān)蛋白GLT-1和GS,并且具有清除谷氨酸的功能,GLT-1和GS的表達和谷氨酸清除功能均于誘導(dǎo)分化反應(yīng)第14d時達到高峰。
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【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R741

【參考文獻】

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本文編號：2381123