發(fā)布時(shí)間：2018-12-10 23:06

【摘要】：第一部分 rBMSCs分泌IL-6改善HIBD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能目的明確大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)來(lái)源的IL-6在移植治療缺氧缺血性腦損傷(HIBD)大鼠中的作用。方法將7日齡SD大鼠通過(guò)Rice法結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈,建立HIBD模型,5d后將腦損傷大鼠隨機(jī)分為HIBD組、HIBD+MSCs組、HIBD+GFP MSCs組和HIBD+si IL-6 MSCs組,后三組大鼠每只經(jīng)側(cè)腦室注射5μl含2×105個(gè)不同處理rBMSCs的細(xì)胞懸液,HIBD組注射等體積滅菌PBS。ELISA檢測(cè)rBMSCs培養(yǎng)上清中IL-6、IL-10、TNFα、IFNβ、IL-8和IL-1β分泌水平。rBMSCs移植2d和9d后取大鼠左側(cè)腦組織通過(guò)ELISA檢測(cè)IL-6水平;移植9d后取大鼠腦組織進(jìn)行TUNEL染色,檢測(cè)左側(cè)腦組織細(xì)胞凋亡情況;移植3w后行Object-in-place檢測(cè)各組大鼠對(duì)新事物的探索能力,4w后行Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能,6w后通過(guò)LTP檢測(cè)大鼠海馬突觸可塑性。結(jié)果(1)Morris水迷宮檢測(cè)顯示,rBMSCs移植組大鼠在訓(xùn)練過(guò)程中找到平臺(tái)所用時(shí)間較HIBD組短,撤去平臺(tái)后穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)較HIBD組顯著增加(P0.05);而si IL-6 MSCs移植組大鼠在訓(xùn)練過(guò)程中找到平臺(tái)所用時(shí)間卻較HIBD+GFP MSCs組長(zhǎng),撤去平臺(tái)后穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)較HIBD+GFP MSCs組明顯減少(P0.05)。(2)Object-in-place檢測(cè)結(jié)果顯示,rBMSCs移植組大鼠對(duì)新事物的探索能力明顯強(qiáng)于HIBD組(P0.05),但si IL-6 MSCs移植組大鼠對(duì)新事物的探索能力卻顯著弱于HIBD+GFP MSCs組(P0.05)。(3)LTP檢測(cè)顯示,rBMSCs移植組大鼠海馬腦片在高頻電刺激后f EPSP(134.2%±4.3%)增加明顯多于HIBD組(117.1%±4.6%),而si IL-6 MSCs移植組大鼠海馬腦片的f EPSP(131.2%±4.8%)增加幅度明顯弱于HIBD+GFP MSCs組(160%±4.5%)。(4)ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,rBMSCs分泌的IL-6水平明顯高于其他細(xì)胞因子(IL-10、TNFα、IFNβ、IL-8和IL-1β)。(5)TUNEL染色分析結(jié)果表明,rBMSCs移植組大鼠左側(cè)大腦皮層中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于HIBD組(P0.05),但si IL-6 MSCs移植組大鼠左側(cè)大腦皮層中凋亡細(xì)胞數(shù)卻明顯多于HIBD+GFP MSCs組(P0.05)。(6)ELISA檢測(cè)損傷大鼠左側(cè)腦組織中IL-6水平,發(fā)現(xiàn)rBMSCs移植組IL-6水平在移植后2d和9d均顯著高于HIBD組(P0.05),而si IL-6 MSCs移植組大鼠左側(cè)腦組織中IL-6水平卻明顯低于HIBD+GFP MSCs組(P0.05)。結(jié)論(1)rBMSCs內(nèi)源性高表達(dá)IL-6。(2)rBMSCs移植可改善HIBD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和對(duì)新事物的探索能力,增強(qiáng)海馬突觸可塑性;然而沉默rBMSCs中IL-6可減弱rBMSCs對(duì)HIBD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和對(duì)新事物探索能力的改善作用,降低海馬突觸可塑性。(3)rBMSCs移植可增加HIBD大鼠腦組織中IL-6分泌水平,抑制HIBD大鼠腦細(xì)胞凋亡;抑制rBMSCs中IL-6分泌水平后,HIBD大鼠腦組織中IL-6分泌水平顯著降低,rBMSCs抑制HIBD大鼠腦細(xì)胞凋亡作用明顯減弱。第二部分 rBMSCs來(lái)源IL-6激活神經(jīng)元STAT3信號(hào)通路抑制HIBD所致炎癥因子分泌目的探討rBMSCs來(lái)源IL-6在移植治療HIBD過(guò)程中對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用的可能機(jī)制。方法體外原代培養(yǎng)胎鼠海馬神經(jīng)元,于培養(yǎng)第5d經(jīng)NSE鑒定其純度。將培養(yǎng)第5d的原代神經(jīng)元行OGD損傷,隨后再分別與rBMSCs、si IL-6 MSCs及GFP MSCs分離共培養(yǎng),同時(shí)以O(shè)GD損傷或未損傷為對(duì)照組。第6d提取神經(jīng)元總RNA,real-time PCR分別檢測(cè)IL-6R、STAT3、Bax、Bcl-2和SOCS1的m RNA表達(dá)水平;Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況。第7d收集培養(yǎng)上清,ELISA檢測(cè)上清中IL-6分泌水平;western blot檢測(cè)IL-6R、STAT3、Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。同時(shí)分別在rBMSCs移植后2d和9d,提取HIBD、HIBD+MSCs、HIBD+si IL-6 MSCs和HIBD+GFP MSCs四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的大鼠腦組織,ELISA檢測(cè)左側(cè)腦組織中IFNγ和IP-10的表達(dá)水平;并利用免疫熒光雙標(biāo)染色檢測(cè)rBMSCs移植后9d HIBD+si IL-6 MSCs組及HIBD+GFP MSCs組大鼠左側(cè)腦組織中NSE/Bcl-2共定位表達(dá)情況。結(jié)果(1)經(jīng)NSE免疫熒光觀察,發(fā)現(xiàn)原代胎鼠海馬神經(jīng)元NSE陽(yáng)性率90%,純度滿足實(shí)驗(yàn)要求。(2)rBMSCs與OGD損傷后的神經(jīng)元分離共培養(yǎng)后,神經(jīng)元培養(yǎng)上清中IL-6水平顯著增高(P0.05),IL-6R、STAT3 m RNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P0.05);但control、OGD和OGD+MSCs三組神經(jīng)元中Bax、Bcl-2 m RNA和蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異,Annexin V-FITC/PI雙染也顯示上述三組神經(jīng)元凋亡情況無(wú)明顯差異。(3)si IL-6 MSCs與OGD損傷后的神經(jīng)元分離共培養(yǎng)后,神經(jīng)元培養(yǎng)上清中IL-6水平較對(duì)照組明顯降低(P0.05),IL-6R、STAT3 m RNA和蛋白表達(dá)水平也較對(duì)照組顯著下降(P0.05);但OGD+si IL-6 MSCs和OGD+GFP MSCs兩組中Bax、Bcl-2 m RNA和蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異,兩組神經(jīng)元凋亡情況也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(4)si IL-6 MSCs移植后,HIBD+si IL-6 MSCs和HIBD+GFP MSCs兩組大鼠腦組織中NSE/Bcl-2共定位表達(dá)亦無(wú)明顯區(qū)別。(5)IL-6/STAT3信號(hào)通路PCR array檢測(cè)結(jié)果表明,OGD+si IL-6 MSCs組神經(jīng)元的IL-6/STAT3信號(hào)通路中大部分因子表達(dá)水平均較OGD+GFP MSCs組有所下調(diào),其中SOCS1下調(diào)約4倍,為下調(diào)最明顯的因子。(6)real-time PCR檢測(cè)顯示,OGD損傷后的神經(jīng)元與rBMSCs分離共培養(yǎng)后,神經(jīng)元中SOCS1 m RNA表達(dá)水平明顯增高(P0.05),而與si IL-6 MSCs分離共培養(yǎng)后的神經(jīng)元中SOCS1的m RNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低(P0.05)。(7)ELISA檢測(cè)顯示,rBMSCs移植2d和9d后,HIBD大鼠左側(cè)腦組織中IFNγ和IP-10表達(dá)水平均降低(P0.05),而si IL-6 MSCs移植組中的IFNγ和IP-10表達(dá)水平卻較對(duì)照組顯著升高(P0.05)。結(jié)論(1)成功培養(yǎng)了可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的原代胎鼠海馬神經(jīng)元。(2)rBMSCs分離共培養(yǎng)可增加原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清中IL-6水平,激活神經(jīng)元中STAT3信號(hào)通路;當(dāng)沉默rBMSCs中IL-6表達(dá)后,si IL-6MSCs分離共培養(yǎng)可降低原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清中IL-6水平,抑制神經(jīng)元中STAT3信號(hào)通路;但對(duì)神經(jīng)元凋亡均無(wú)顯著影響。此結(jié)果在HIBD大鼠體內(nèi)得到進(jìn)一步驗(yàn)證。(3)rBMSCs來(lái)源的IL-6可激活OGD損傷神經(jīng)元中SOCS1表達(dá)水平,抑制HIBD大鼠腦組織中IFNγ和IP-10的分泌。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R742

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本文編號(hào)：2371379