發(fā)布時間：2018-11-26 07:29

【摘要】：目的：（1）探討CT-1(Cardiotrophin1)是否對hUCB-MSCs神經(jīng)分化具有促進作用，尋找一種合適的細胞因子誘導hUCB-MSCs分化為神經(jīng)樣細胞，可能為神經(jīng)系統(tǒng)疾病修復帶來希望；（2）研究MAPK/ERK信號分子在hUCB-MSCs神經(jīng)分化中的調(diào)控機制。 方法：（1）分離、培養(yǎng)及鑒定hUCB-MSCs：收集人臍帶血標本，用改良密度梯度離心法結合貼壁法分離臍血中單個核細胞，觀察細胞形態(tài)變化并繪制生長曲線，用流式細胞術鑒定細胞表面標志物CD34、CD29、CD44和CD105的表達。（2）病毒轉(zhuǎn)染：將Adv-CT-1及Adv-EGFP（腺病毒增強型綠色熒光蛋白）分別轉(zhuǎn)染hUCB-MSCs，于轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h用免疫熒光染色檢測CT-1表達率，熒光顯微鏡下觀察CT-1和EGFP轉(zhuǎn)染成功率。（3）神經(jīng)標志物及凋亡相關蛋白檢測：免疫熒光分別檢測對照組、EGFP組、CT-1組及NIM組Nestin、NeuN及MBP神經(jīng)標志物表達；WesternBlot方法檢測轉(zhuǎn)染CT-1組及對照組調(diào)亡相關蛋白bcl2、Bax、Bak等表達情況。（4）免疫共沉淀法（CO-IP）及Western Blot法檢測不同時間點hUCB-MSCs的CT-1受體（gp130和LIFRβ）及信號分子p-Raf-1、ERK1/2和p-ERK1/2表達；加入MEK抑制劑后Western Blot法檢測Nestin、NeuN、MBP及p-ERK表達情況。 結果：（1）hUCB-MSCs培養(yǎng)及鑒定：原代細胞培養(yǎng)第5d可見多角形細胞和大量大而圓的破骨樣細胞及雜細胞，12d后可見大量梭形細胞呈集落樣生長，平均28d可以傳代。傳代后約12h后細胞逐漸貼壁，細胞呈均一的梭形細胞，3-5d可再次傳代，P3細胞得到形態(tài)均一，3-4d細胞融合率達90%。分離培養(yǎng)出hUCB-MSCs高表達間充質(zhì)相關抗原CD105（89.31%）、整合素家族CD29（98.41%）、細胞黏附分子CD44（99.20%）、不表達造血干細胞標志CD34。（2）腺病毒轉(zhuǎn)染：病毒轉(zhuǎn)染率隨著時間及MOI的改變而變化，病毒MOI為100PFU/細胞時，在轉(zhuǎn)染72h，轉(zhuǎn)染效率較高（87.60±1.36%）且細胞形態(tài)與生長方式與未感染細胞相同，為最佳轉(zhuǎn)染復數(shù)。（3）CT-1對hUCB-MSCs神經(jīng)誘導分化作用：誘導6h后CT-1組及NIM組即呈類神經(jīng)細胞樣形態(tài)改變，CT-1組變化更明顯；4組中，CT-1組Nestin陽性率最高（86.82±4.29%），差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）；至第4d時，各組Nestin表達明顯減少，CT-1組仍高于其他組，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）；誘導后6h，CT-1組NeuN即有少量表達（14.26±2.20%），隨后逐漸升高，第4d時陽性率達48.33±2.53%；CT-1組陽性率均高于其他各組（P0.05）；誘導后6h，各組MBP均有少量表達，隨后表達率逐漸升高，至第4d時陽性率最高，CT-1組6h（14.12±2.16%）及4d（45.63±2.78%）時MBP陽性率均高于其他各組，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）；CT-1對bax、bak及caspase3等凋亡相關蛋白影響：Western Blot結果顯示CT-1組bcl-2表達較對照組增加，CT-1組凋亡相關蛋白bax、bak、caspase3及caspase9表達（0.01±0.00，0.09±0.01，0.30±0.01，0.32±0.02）低于對照組（0.16±0.01，1.14±0.02，0.58±0.01，0.72±0.01），差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。（4）不同時間點CT-1受體（gp130和LIFRβ）表達及ERK1/2、Raf-1磷酸化表達：轉(zhuǎn)染后24小時，hUCB-MSCs可見p-Raf-1、p-ERK1/2及gp130微弱表達，未見LiFRβ表達；48h見LiFRβ微弱表達，p-Raf-1、p-ERK1/2及gp130表達增強，與24h相比有統(tǒng)計學意義（P0.05）；72h時，gp130/LiFRβ及ERK1/2表達未見進一步增強；p-ERK1/2和p-Raf-1表達仍繼續(xù)增加，與48h相比，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。加入不同濃度PD98059后ERK磷酸化、MBP、NeuN及Nestin水平變化：10umol/L PD98059可使MBP、NeuN、Nestin及p-ERK表達減少（P0.05）；100umol/L PD98059可使MBP、NeuN、Nestin及p-ERK表達明顯減少，，與10umol//L組相比有統(tǒng)計學意義（P0.05）。結論：（1）改良密度梯度結合貼壁培養(yǎng)法可以培養(yǎng)獲得hUCB-MSCs；（2）Adv-CT-1可以高效轉(zhuǎn)染hUCB-MSCs；（3）CT-1可以促進hUCB-MSCs向神經(jīng)方向分化并抑制凋亡；（4）MAPK/ERK信號通路參與hUCB-MSCs神經(jīng)分化的調(diào)控。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R741

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 魯秀敏,王永堂;心肌營養(yǎng)素-1的生物多效性[J];中國臨床康復;2004年12期

2 楊云華,廖維宏,伍亞民,張正豐,李紅運,劉媛,龍在云;腺病毒介導的心肌營養(yǎng)素-1基因轉(zhuǎn)染對神經(jīng)干細胞作用的實驗研究[J];中國脊柱脊髓雜志;2005年06期

3 李同歡;李振宏;杜淑珍;束曉梅;;Adv-CT1轉(zhuǎn)染對神經(jīng)元的作用[J];遵義醫(yī)學院學報;2010年05期

本文編號：2357794