【摘要】：腦膠質(zhì)瘤是一類常見(jiàn)、難治、重要的危害人類健康疾病，其中惡性膠質(zhì)瘤占所有原發(fā)惡性腦腫瘤的80%，預(yù)后差，病死率高，即使手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%~90%，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與間變型星形膠質(zhì)瘤的中位生存期分別只有12~15個(gè)月與2~5年，5年生存率分別僅為4.7%和25.9%。盡管隨現(xiàn)代科技進(jìn)步，新技術(shù)和新藥物不斷應(yīng)用，手術(shù)、放化療、免疫、基因治療或其組合的綜合措施取得了一定進(jìn)展，但惡性膠質(zhì)瘤的總體預(yù)后并未得到根本的改善，因此，闡明腦膠質(zhì)瘤分子病理機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和策略以及可用于判斷預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的相關(guān)分子靶標(biāo)，從而提高膠質(zhì)瘤的綜合療效已成為神經(jīng)外科領(lǐng)域的前沿課題。 腦膠質(zhì)瘤的惡變是基因畸變的積累與生長(zhǎng)因子信號(hào)通路異常調(diào)控的結(jié)果，這一過(guò)程包含了PI3K、p53、RB、MAPK等多條通路，并可能涉及到腫瘤細(xì)胞粘附、基質(zhì)降解、遷移、細(xì)胞增殖等諸多環(huán)節(jié)，但目前其具體的機(jī)制仍不清楚。因此，腦膠質(zhì)瘤治療取得突破的關(guān)鍵因素就是找到其發(fā)生、增殖、侵襲過(guò)程中的上游核心調(diào)控基因，針對(duì)這些關(guān)鍵調(diào)控基因的分子靶向療法則是膠質(zhì)瘤治療的新思路和新方向。挖掘出既能反應(yīng)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性，又能輔助制定放化療策略和預(yù)測(cè)預(yù)后的特征性分子靶標(biāo)具有重要的臨床意義，以實(shí)現(xiàn)真正意義上的分子靶向治療。 高通量技術(shù)的出現(xiàn)無(wú)疑為分子靶向治療的實(shí)現(xiàn)提供強(qiáng)有力的工具。利用二代測(cè)序、基因芯片、組織芯片等技術(shù)不僅能對(duì)腫瘤樣本進(jìn)行分析，分辨疾病的亞型，還可以預(yù)測(cè)疾病的預(yù)后和對(duì)藥物、放射線的敏感性，進(jìn)而實(shí)施個(gè)體化治療。在治療中我們發(fā)現(xiàn)，即使是相同病理類型和級(jí)別的膠質(zhì)瘤，同樣的治療方法，其治療效果也存在著很大的差異。腫瘤的內(nèi)在分子水平上的差異是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的最關(guān)鍵因素。若在治療前，就能預(yù)先發(fā)現(xiàn)特殊的腫瘤基因的突變、缺失等各種表型改變，進(jìn)而可判斷患者對(duì)治療的反應(yīng)和預(yù)后，則毫無(wú)疑問(wèn)能為治療提供更多的選擇性和針對(duì)性并可能顯著提高療效。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道MGMT、IDH1、1p/19q等多個(gè)基因的甲基化、突變或缺失可用于判斷部分膠質(zhì)瘤亞型對(duì)替莫唑胺等化療藥物的敏感性，并且可作為預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，但這些著名靶標(biāo)尚沒(méi)有膠質(zhì)瘤的特異性。 近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程的作用不斷被揭示，越來(lái)越多的證據(jù)表明，特定mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控與腫瘤相關(guān)基因表達(dá)水平變化密切相關(guān)，且這種調(diào)控主要是通過(guò)3'非翻譯區(qū)的順式作用元件實(shí)現(xiàn)的。胞質(zhì)聚腺苷酸化元件（Cytoplasmic polyadenylation element，CPE）即為已知的元件之一，在上百種涉及細(xì)胞增殖及分化的mRNA上均有表達(dá)。CPE結(jié)合蛋白（CPEB）是一組高度保守，包含有RNA識(shí)別序列及鋅指結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)合蛋白，能夠促進(jìn)多聚腺苷酸化誘導(dǎo)的翻譯過(guò)程并能介導(dǎo)包括干細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞分化和細(xì)胞衰老等過(guò)程。CPEB4是CPEB家族中的一員，已有研究發(fā)現(xiàn)其在胰腺癌組織中過(guò)表達(dá)，且表達(dá)水平高低與腫瘤惡性程度成正相關(guān)；另有文獻(xiàn)報(bào)道CPEB4在GBM中過(guò)表達(dá)（同一篇文獻(xiàn)？），但CPEB4表達(dá)量與腫瘤惡性程度、發(fā)生發(fā)展、增殖侵襲及預(yù)后的關(guān)系，國(guó)際上尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)從組織水平和細(xì)胞水平，通過(guò)高通量組織芯片、靶向RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建、RT-PCR、Western blot，以及細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等體外實(shí)驗(yàn)方法，探索研究CPEB4蛋白表達(dá)量與患者預(yù)后的關(guān)系，并初步探討其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的功能表型及可能的通路和分子機(jī)制。 第一部分：CPEB4在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及預(yù)后相關(guān)研究 目的：CPEB4是CPEB家族中的重要一員，在細(xì)胞生理和病理過(guò)程中，調(diào)控有絲分裂、減數(shù)分裂細(xì)胞周期及細(xì)胞衰老，其在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的重要作用，提示可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但其在膠質(zhì)瘤領(lǐng)域中研究尚很少。本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建高通量組織芯片和免疫組化的方法，研究CPEB4在各級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，并分析CPEB4的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系。 方法：1）、收集經(jīng)臨床病理證實(shí)為膠質(zhì)瘤的病理標(biāo)本共計(jì)300例（通過(guò)2000年1月至2010年12月第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)外科腫瘤切除手術(shù)取得）；正常腦組織16例（通過(guò)外傷減壓手術(shù)取得）；制備成高通量的膠質(zhì)瘤組織芯片；2）、利用組織芯片、免疫組化方法研究CPEB4在腫瘤細(xì)胞中的亞定位及其蛋白在各個(gè)級(jí)別膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達(dá)情況，并分析級(jí)別與表達(dá)量的關(guān)系；3）、對(duì)300例膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行隨訪，獲得其生存期，分析CPEB4表達(dá)量與膠質(zhì)瘤患者生存期的關(guān)系。 結(jié)果：在正常腦組織中CPEB4主要表達(dá)在神經(jīng)元內(nèi)，在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)很少；在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CPEB4主要表達(dá)在胞漿內(nèi)，，各級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)均高于正常腦組織(P0.05)，其表達(dá)強(qiáng)度隨級(jí)別增高而增高，呈正相關(guān)，低級(jí)別和高級(jí)別膠質(zhì)瘤之間的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；CPEB4的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后有相關(guān)性，Log-rank單因素分析顯示CPEB4表達(dá)高者的總體生存期（OS）和無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）較CPEB4表達(dá)低者均明顯縮短，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P值均＜0.001），但經(jīng)病理級(jí)別校正后P值分別為0.065和0.059，提示CPEB4表達(dá)量與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的相關(guān)性受到病理級(jí)別的影響。在原發(fā)GBM中，Log-rank單因素分析顯示高表達(dá)CPEB4患者的OS和PFS均明顯低于低表達(dá)者（兩者p值均為0.011），Cox多因素分析顯示CPEB4表達(dá)水平是原發(fā)GBM患者OS和PFS的獨(dú)立預(yù)后相關(guān)因素（OS:HR=2.017, p=0.003；PFS: HR=1.810,p=0.009）。 結(jié)論：正常腦組織中CPEB4僅少量表達(dá)在神經(jīng)元中。膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CPEB4主要表達(dá)在細(xì)胞胞漿內(nèi)，其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別密切相關(guān)，提示CPEB4可能參與到膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展、增殖侵襲等過(guò)程中。在原發(fā)GBM患者中，CPEB4表達(dá)量與預(yù)后相關(guān)性顯著，是原發(fā)GBM患者預(yù)后的獨(dú)立相關(guān)因素，提示CPEB4是一個(gè)潛在的原發(fā)GBM的預(yù)后判斷靶標(biāo)。 第二部分：CPEB4參與膠質(zhì)瘤增殖侵襲的體外實(shí)驗(yàn)研究和機(jī)制探索 目的：在上一部分中我們已證明CPEB4在膠質(zhì)瘤組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平隨腫瘤病理級(jí)別升高而上升，呈正相關(guān)，提示CPEB4可能與膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。在本部分中，擬構(gòu)建靶向CPEB4干擾的穩(wěn)定慢病毒載體，轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞，在體外實(shí)驗(yàn)中研究CPEB4表達(dá)水平改變對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，并探討可能的通路和機(jī)制。 方法：1）設(shè)計(jì)siRNA靶點(diǎn)，合成高效干擾序列，與慢病毒載體連接，并利用熒光顯微鏡，定量RT-PCR、Western blot驗(yàn)證RNA干擾效果；2）靶向CPEB4的RNA干擾慢病毒載體感染膠質(zhì)瘤T98細(xì)胞后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖曲線變化、流式細(xì)胞儀測(cè)腫瘤細(xì)胞周期與凋亡；3）、熒光定量PCR檢測(cè)CPEB4表達(dá)量改變后膠質(zhì)瘤增殖、侵襲、耐藥等相關(guān)分子表達(dá)量的變化。 結(jié)果：靶向CPEB4的RNA干擾和過(guò)表達(dá)慢病毒載體感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞后有效的改變了細(xì)胞內(nèi)源性CPEB4的表達(dá)水平，與對(duì)照組相比差異顯著。CPEB4表達(dá)量降低后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞周期停滯于G1期，但細(xì)胞凋亡無(wú)明顯改變。CPEB4表達(dá)量降低后，腫瘤相關(guān)重要分子SMAD3、PIK3CA和IGF2的mRNA表達(dá)水平明顯降低。 結(jié)論：CPEB4參與調(diào)控了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖侵襲，SMAD3、PIK3CA、IGF2可能參與其中發(fā)揮作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.41

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2336901