【摘要】：目的人腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,惡性膠質(zhì)瘤的侵襲和復發(fā)率都明顯高于顱內(nèi)其他腫瘤。特別是膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma,GBM)預后差、易復發(fā),嚴重影響患者生活和生存質(zhì)量,其中GBM患者中位生存期在1年左右。在當前精準醫(yī)學概念的指導下,傳統(tǒng)的腫瘤分型正逐步轉向以分子遺傳特征為基礎的新診斷體系。癌癥基因組圖譜計劃(The Cancer Genome Atlas,TCGA)研究結果表明,包括表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)、β-連環(huán)素(β-catenin)、非編碼RNA HOTAIR為代表的多個癌基因突變、擴增是人腦膠質(zhì)瘤發(fā)病過程中的重要分子事件。當前觀點認為,Wnt/β-catenin等在內(nèi)的多個信號通路與EGFR信號通路之間的協(xié)同作用和交互調(diào)節(jié)導致膠質(zhì)瘤向快速生長期轉變,也是惡性膠質(zhì)瘤治療失敗的重要原因。因此,尋找膠質(zhì)瘤中EGFRwt/vIII與β-catenin信號通路調(diào)節(jié)關鍵基因及其分子機制,成為影響膠質(zhì)瘤靶向治療效果關鍵所在。方法1、對中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計劃(Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA)和TCGA提供的人腦膠質(zhì)瘤標本全基因組測序數(shù)據(jù)分析HOTAIR表達;收集整理CGGA提供膠質(zhì)瘤標本的性別、KPS評分等數(shù)據(jù);隨訪CGGA生存期;焦磷酸測序法檢測CGGA所有標本中異檸檬酸脫氫酶同工酶1(IDH1)和甲基鳥嘌呤甲基轉移酶(MGMT)突變頻率;免疫組織化學染色化學染色法檢測MGMT、人增殖細胞核核抗原(Ki-67)、EGFR、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)表達;Cox回歸分析HOTAIR表達與膠質(zhì)瘤標本臨床特征關系。2、U87人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞經(jīng)表達HOTAIR干擾RNA的慢病毒載體(Lenti-HOTAIR si)侵染48h后,提取總RNA,使用Illumina HiSeqTM 2000系統(tǒng)進行測序,篩選差異表達基因。篩選Nemo樣激酶(Nemo-like kinase,NLK)作為HOTAIR靶基因。3、Lenti-HOTAIR si轉染U87和U87vIII細胞,蛋白印跡(Western blot)檢測Nemo樣激酶(Nemo-like kinase,NLK)表達;染色體免疫共沉淀法檢測免疫共沉淀法檢測HOTAIR調(diào)控NLK轉錄;免疫共沉淀PKM2與β-catenin相互作用;熒光素酶實驗檢測β-catenin信號通路轉錄活性變化;流式細胞術檢測敲低hotair后gbm細胞周期變化;克隆形成實驗、transwell實驗和劃痕實驗檢測gbm侵襲、遷移能力變化;wb檢測細胞周期、上皮間質(zhì)轉化相關蛋白表達變化。4、建立不同hotair表達水平的u87和u87viiigbm裸鼠顱內(nèi)模型,使用小動物成像系統(tǒng)檢測腫瘤大小;he染色檢測腫瘤細胞形態(tài)變化,免疫組化檢測ki-67、nlk、p21等蛋白表達變化。結果1、通過對cgga中310例膠質(zhì)瘤和5例正常腦組織標本中hotair表達狀態(tài)的分析顯示,hotair在gbm中表達高于低級別膠質(zhì)瘤(lowgradeglioma,lgg)和正常腦組織(p0.05);kaplan-meier生存分析顯示hotair高表達gbm患者生存較差(p0.05);單因素回歸分析提示hotair表達與患者確診年齡、mgmt啟動子甲基化相關(p0.05);與性別、kps評分、是否完整切除、mgmt、pten、ki67表達無關(p0.05)。多因素cox回歸分析提示hotair表達、確診年齡、idh1突變、kps評分和ki67表達等與gbm患者總生存負相關(p0.05)。2、通過對比是否轉染lenti-hotairsi的u87mg細胞rna測序結果,我們發(fā)現(xiàn)1288個過表達基因和1628個低表達基因。通過比對cgga數(shù)據(jù)庫,初步鑒定nlk是hotair下游候選靶基因。nlk表達在高級膠質(zhì)瘤(highgradeglioma,hgg)中表達較lgg降低(p0.05);就cgga數(shù)據(jù)庫中gbm標本中hotair與nlk表達負相關(r=0.156,p0.05)。westernblot證實,敲低hotair表達后,nlk表達升高;chip-pcr證實,h3k27me3在nlk5'非翻譯區(qū)(5'utr)和轉錄起始位點上游3kb范圍內(nèi)有結合位點,hotair抑制nlk轉錄。3、敲低u87mg和u87viiimg細胞中hotair表達后,top-fop熒光素酶實驗證實,β-catenin轉錄活性下調(diào)(p0.05);總β-catenin(-p)和組分蛋白β-catenin(-p)表達下調(diào)(p0.05);細胞周期阻滯于g1期;rb(-p)、p21和p16表達升高;cyclind1、e2f1表達降低(p0.05);2-d基質(zhì)生長實驗示gbm細胞敲低hotair細胞降解細胞外基質(zhì)、增殖能力下降(p0.05);transwell和劃痕實驗證實敲低hotair后gbm細胞侵襲、遷移能力下降(p0.05);westernblott提示e-cadherin表達升高;n-cadherin、nf-κb、zeb-1、twist-1表達下降(p0.05)。4、動物實驗結果提示,敲低HOTAIR表達的U87MG和U87vIIIMG裸鼠顱內(nèi)生存期高于對照組(P0.05);小動物成像和HE染色提示Lenti-HOTAIR si轉染組腫瘤體積小于對照組(P0.05);IHC檢測提示:敲低HOTAIR表達后,NLK和p21表達升高;Ki67、β-catenin、Slug表達降低。結論綜上所述,本研究首次鑒定膠質(zhì)瘤中非編碼RNA HOTAIR下游靶基因,且初步闡述膠質(zhì)瘤中HOTAIR參與調(diào)控β-catenin信號通路的生物學功能以及作為治療靶點前的前景。具有以下三個重要的理論方法和實踐意義:(1)首次應用通過對比CGGA數(shù)據(jù)庫和體外細胞系中RNA-seq數(shù)據(jù),篩選出候選靶基因;為今后開展針對LncRNA的基礎研究提供方法學依據(jù);(2)通過基于H3K27me3的CHIP-PCR方法鑒定膠質(zhì)瘤中HOTAIR參與抑制NLK轉錄的具體位點和機制;(3)體內(nèi)外實驗證明干擾HOTAIR表達,可以抑制不同EGFR狀態(tài)GBM細胞細胞周期演進、侵襲、遷移能力;干擾β-catenin通路的激活及生物學效應;HOTAIR是一個頗具治療前景的候選靶基因。本研究結果有助于我們初步了解膠質(zhì)瘤中最具特點的癌LncRNA的作用機制,為從RNA角度揭示膠質(zhì)瘤發(fā)病機制、優(yōu)化膠質(zhì)瘤治療策略提供實驗基礎。
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【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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1 Lihua Huang;Liwu Fu;;Mechanisms of resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors[J];Acta Pharmaceutica Sinica B;2015年05期

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本文編號：2316754