【摘要】：背景與目的卒中是世界范圍內(nèi)第四位致死原因,是中國人群第一位致死和致殘原因。缺血性卒中由于血管閉塞引起供血區(qū)域氧、糖供應障礙,引起二級損傷級聯(lián)瀑布,導致神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞死亡。目前只有組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator, tPA)是具有循證醫(yī)學依據(jù)的急性卒中治療手段。但尚沒有其他神經(jīng)保護或者神經(jīng)修復治療手段被證明是有效的,所以尋找新型、有效的神經(jīng)保護、修復手段非常有必要。隨著干細胞技術的發(fā)展,人類胚胎干細胞/多能誘導干細胞已被證明能分化成各種類型的神經(jīng)元,為其在卒中細胞治療中的應用提供了基礎。可行的思路是通過移植具有神經(jīng)元分化能力的神經(jīng)前體細胞、重建卒中后受損腦組織的神經(jīng)網(wǎng)絡。研究證實神經(jīng)前體細胞移植后能在腦組織中分化成神經(jīng)元并且促進神經(jīng)功能的恢復的效果。然后目前限制人胚胎干細胞/多能誘導干細胞來源的神經(jīng)前體細胞向臨床轉化的一大難題是,神經(jīng)前體細胞一方面在移植后存活比例低,而存活細胞具有強大增殖活性,有導致腫瘤形成風險。有報道稱γ-分泌酶抑制劑抑制Notch通路是卒中細胞治療優(yōu)化的可行手段。Notch是調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細胞增殖和分化的重要分子,干擾Notch是調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細胞的增殖與分化的一個新穎思路。缺血預適應被普遍認為是提高細胞對致死性打擊的承受能力的手段。我們的前期數(shù)據(jù)表明Botch是介導缺血預適應神經(jīng)保護作用的核心分子。而另一方面,最新研究表明,Botch是內(nèi)源性的Notch抑制劑；可以通過限制Notch的furin樣轉化抑制Notch分子的剪切成熟和信號轉導�；谶@些基礎,我們嘗試通過在神經(jīng)前體細胞過表達Botch來調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細胞在體外和移植后的存活、增殖和分化,考察Botch過表達是否是增加細胞移植神經(jīng)修復功能的有效方法。材料與方法1.通過轉座子技術使得人胚胎干細胞(human embryonic stem cells, hESCs)系H1能夠穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白(GFP)或者紅色熒光蛋白(dsRed)。利用雙細胞移植體系統(tǒng),對神經(jīng)前體細胞(human neural precursor cells, hNPCs)階段的dsRed陽性hNPCs給予OGD或者NMDA預處理,而EGFP陽性hNPCs不做處理作為對照。兩種細胞等量均勻混合后移植入卒中1天后的免疫缺陷小鼠梗塞皮質(zhì)。通過熒光信號可以追蹤移植細胞團的體積和形態(tài)成熟,通過免疫熒光染色考察細胞的增殖和存活。2.通過對缺血預處理過的人NPCs進行RNA測序篩選,并且結合前期工作基礎,我們認為Botch可能是介導缺血預處理和調(diào)節(jié)細胞增殖、分化的有效靶點。通過實時定量PCR技術考察Botch在不同階段人類細胞的表達譜,通過westernblot考察Botch在細胞、組織中的表達。3.通過慢病毒載體在hNPCs過表達Botch-EGFP,或者表達EGFP作為對照。Western blot確認過表達效率。Botch過表達對細胞增殖、死亡和成熟皮層神經(jīng)元分化的作用通過免疫熒光染色鑒定。4.在體內(nèi)細胞移植實驗中,我們將過表達Botch的人NPCs或者對照hNPCs移植入卒中后1天的免疫缺陷NSG小鼠梗塞皮層。通過綠色熒光信號觀察移植細胞團的體積、移植細胞的分布和突起形成。通過免疫熒光染色觀察細胞在梗塞皮層的存活、增殖和向神經(jīng)元的分化及整合。通過階梯食物獲取實驗和意面獲取實驗觀察Botch過表達的hNPCs能否促進卒中小鼠的神經(jīng)功能恢復。結果1.缺血預適應可以限制移植人神經(jīng)前體細胞(human neural precursor cells, hNPCs)在梗塞皮層的增殖：我們連續(xù)觀察了雙細胞系統(tǒng)移植后4周、8周、12周和16周的移植物體積、密度、移植細胞增殖和存活情況。結果表明盡管OGD/NMDA缺血預適應沒能顯著抑制移植物體積或者改善移植細胞的存活,但是可以短暫抑制細胞Ki67+的比例,以及降低移植細胞的密度。2. Botch可能是缺血預適應的關鍵分子：我們的RNA測序結果提示,Botch在OGD預處理和NMDA預處理后的hNPCs中表達上升。在hESCs向EB、hNPCs和神經(jīng)元分化的過程中,hNPCs階段Botch基因表達和蛋白水平最低。另外也有證據(jù)提示抑制Botch可以抵消缺血預適應的效應。3. Botch過表達可以抑制人神經(jīng)前體細胞增殖、促進分化,并對神經(jīng)元提供神經(jīng)保護：我們對分化到神經(jīng)前體細胞階段的hESCs來源的hNPCs進行慢病毒載體感染,過表達Botch-EGFP或者EGFP。結果提示Botch過表達能抑制神經(jīng)前體細胞和神經(jīng)母細胞的增殖能力,但對細胞的存活不造成壓力；并促進hNPCs向MAP2+成熟神經(jīng)元、Tbrl+或者Ctip2+深層皮層神經(jīng)元以及Gad67+抑制性神經(jīng)元的分化。此外,hESCs來源的神經(jīng)元過表達Botch可以顯著提高神經(jīng)元對致死性OGD損傷或者NMDA損傷的抵抗能力。4. Botch過表達限制移植hNPCs的過度增殖、促進分化和卒中后的神經(jīng)功能恢復：體內(nèi)細胞移植結果提示,Botch過表達能夠降低移植后4周、8周細胞內(nèi)的Ki67+比例并且限制移植物的體積過度增殖。同時Botch過表達能降低caspase3+細胞的比例,提示細胞存活得到改善。Botch過表達不影響移植細胞投射到皮質(zhì)、胼胝體以及紋狀體的投射,但能夠顯著促進hNPCs分化而來的神經(jīng)元的突起長度。就皮層神經(jīng)元分化角度,Botch過表達能促進移植的hNPCs向Tbrl+、Ctip2+皮層神經(jīng)元分化。最重要的是,過表達Botch的神經(jīng)前體細胞移植能夠顯著促進卒中后小鼠的精細運動功能的恢復。結論與意義1.缺血預適應能夠短暫限制移植物增殖：我們用雙細胞系統(tǒng)移植體系,避免了個體差異帶來的實驗誤差。結果提示缺血預適應沒有能夠顯著促進移植細胞的存活,這可能與缺血預適應的作用具有短時性有關。但是缺血預適應能夠顯著抑制移植早期的細胞增殖,從而降低移植物內(nèi)的細胞總數(shù)。2. Botch介導缺血預適應效應的關鍵分子：缺血預適應效果具有短時性和局限性,我們通過RNAseq等技術篩選出Botch,并在功能實驗中證實Botch是介導缺血預適應的核心分子。此外,在hNPCs階段Botch表達水平最低,我們預測可以通過在hNPCs階段過表達Botch調(diào)控其存活、增殖、分化。3. Botch過表達抑制hNPCs增殖、提供神經(jīng)保護并且促進神經(jīng)元分化：我們的結果提示Botch對不同分化階段的細胞具有不同作用。Botch通過抑制Notch信號通路,抑制具有高度增殖活性的神經(jīng)前體細胞和神經(jīng)母細胞的增殖,促進其向皮層神經(jīng)元的分化；但對分化成熟的神經(jīng)元增加其對缺血打擊的承受能力。同時,Botch過表達可以提高神經(jīng)前體細胞向成熟神經(jīng)元和深層皮層神經(jīng)元、抑制性神經(jīng)元的分化。Botch的這些特性共同提示Botch可能是提高細胞移植安全性、有效性的重要靶點。4. Botch過表達提高細胞移植安全性、促進神經(jīng)元分化和功能恢復：過表達Botch的hNPCs在移植入小鼠梗塞皮層后過度增殖得到抑制,同時成熟細胞存活得到改善。移植細胞可以向深層皮層神經(jīng)元分化,并且能形成突觸結構。更重要的是過表達Botch的hNPCs移植可以顯著加速卒中后小鼠的神經(jīng)功能恢復,這可能跟Botch提高神經(jīng)元存活、促進抑制性神經(jīng)元分化中和興奮性損傷有關。這些結果共同提示Botch可以通過對不同階段的神經(jīng)細胞發(fā)揮不同效應,使得hNPCs移植更加安全、有效。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

【相似文獻】

相關期刊論文 前5條

1 白金柱;劉忠軍;徐光輝;丁為民;沈麗;王凡;田嘉禾;王巖;;人神經(jīng)前體細胞多巴胺D_2受體在體外和移植入脊髓后的表達[J];中國臨床康復;2006年21期

2 許秋巖;張海燕;李衛(wèi)紅;劉揚;徐群淵;趙詠梅;;人神經(jīng)前體細胞分化過程中p27~(Kip1)的作用及其調(diào)節(jié)機制研究[J];中國藥理學通報;2008年08期

3 趙詠梅;許秋巖;張海燕;李衛(wèi)紅;徐群淵;;p27~(Kip1)在永生化人神經(jīng)前體細胞分化中的作用研究[J];神經(jīng)解剖學雜志;2010年04期

4 許秋巖;趙詠梅;王一松;李衛(wèi)紅;劉揚;徐群淵;張海燕;;p27~(Kip1)在RA誘導人神經(jīng)前體細胞分化中的作用[J];中國藥理學通報;2008年02期

5 ;[J];;年期

相關會議論文 前1條

1 欒佐;劉衛(wèi)鵬;屈素清;胡曉紅;汪兆艷;賀聲;劉翠青;肖敏;;人神經(jīng)前體細胞移植治療新生兒獲得性腦損傷的臨床觀察[A];中華醫(yī)學會第十七次全國兒科學術大會論文匯編（上冊）[C];2012年

相關博士學位論文 前1條

1 朱玨華;缺血預適應篩選的Botch過表達優(yōu)化人神經(jīng)前體細胞治療卒中的方案[D];南京大學;2014年

，

本文編號：2303961