【摘要】：【目的】中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病表現(xiàn)為腦或脊髓遭受細(xì)菌入侵而產(chǎn)生的一系列臨床癥狀,是神經(jīng)科常見的疾病之一。其中細(xì)菌性腦膜炎(bacterial meningitis,BM)發(fā)病迅速,需要及時(shí)明確診斷實(shí)施有效的抗生素治療,然而在臨床實(shí)踐中,BM的診斷金標(biāo)準(zhǔn)腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)陽性率低、耗費(fèi)時(shí)間長,難以滿足臨床需要。不僅如此,BM患者往往罹患認(rèn)知記憶功能損害、聽力下降等后遺癥,臨床尚無有效治療方法,給患者及社會(huì)帶來巨大負(fù)擔(dān),因此,早期明確診斷及控制晚期后遺癥是神經(jīng)科醫(yī)生迫切需要解決的兩大難題。降鈣素原(Procalcitonin,PCT)是細(xì)菌感染特異性誘導(dǎo)因子,組織細(xì)胞如脂肪細(xì)胞等受到細(xì)菌及細(xì)菌成分如內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激時(shí)均可表達(dá)釋放PCT入血,因此血清PCT是外周細(xì)菌感染、膿毒血癥等良好診斷標(biāo)志物。然而腦內(nèi)細(xì)胞受到細(xì)菌及LPS刺激后是否也存在類似PCT的表達(dá)及分泌卻尚不明確。已知腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞在細(xì)菌及LPS刺激下明顯活化增生,伴有炎性因子等多種蛋白表達(dá)增多,因此,我們擬首先探討腦內(nèi)細(xì)胞在細(xì)菌及LPS刺激下PCT表達(dá)與分泌情況,為PCT作為腦內(nèi)細(xì)菌感染診斷標(biāo)志物提供理論基礎(chǔ)。既往已有大量文獻(xiàn)證實(shí)BM患者后遺癥的發(fā)生與腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞所介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥網(wǎng)絡(luò)過度放大有關(guān)。作為腦內(nèi)含量最豐富的膠質(zhì)細(xì)胞,在細(xì)菌感染過程中,星形膠質(zhì)細(xì)胞迅速增殖活化,對于放大神經(jīng)炎癥網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮了最為關(guān)鍵的作用。因此,通過凋亡或生長周期阻滯減少過度活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目是調(diào)控神經(jīng)炎癥網(wǎng)絡(luò)的有效方法。在腫瘤領(lǐng)域研究中發(fā)現(xiàn),生長阻滯特異性蛋白1(Growth arrest specific 1,Gas1)可以抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡,近期有研究證明腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Gas1,但功能尚不明確,那么,Gas1是否參與了星形膠質(zhì)細(xì)胞的命運(yùn)調(diào)控?我們進(jìn)一步探索Gas1在活化星形膠質(zhì)細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控作用以及可能的信號(hào)通路。本研究借助細(xì)菌感染過程中重要的致炎成分LPS建立神經(jīng)炎癥模型,研究星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化、PCT的表達(dá)分泌,及活化星形膠質(zhì)細(xì)胞的命運(yùn)問題。【方法】首先建立肺炎鏈球菌及LPS腦內(nèi)注射神經(jīng)炎癥模型,通過免疫熒光雙標(biāo)記染色、western blot及Elisa觀察腦內(nèi)PCT的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)及腦脊液血清PCT含量變化,體外判斷星形膠質(zhì)細(xì)胞PCT的表達(dá)及分泌。然后觀察LPS腦內(nèi)注射神經(jīng)炎癥模型活化星形膠質(zhì)細(xì)胞Gas1的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況,體外通過LPS及炎性因子刺激原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,利用Brdu摻入實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、CCK8、LDH釋放實(shí)驗(yàn)、ROS檢測、Tunel等方法觀察細(xì)胞周期、細(xì)胞活力、凋亡等變化及與Gas1表達(dá)的關(guān)系,進(jìn)一步設(shè)計(jì)針對Gas1的si RNA序列干擾活化星形膠質(zhì)細(xì)胞Gas1的表達(dá),判斷Gas1對活化星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響,通過western blot方法分析Gas1胞內(nèi)信號(hào)通路。【結(jié)果】1.肺炎鏈球菌及LPS腦內(nèi)注射神經(jīng)炎癥模型海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化,伴有PCT表達(dá)顯著升高,CSF PCT含量升高,同時(shí)海馬神經(jīng)元及CSF中滲入的中性粒細(xì)胞陽性表達(dá)PCT。2.人腦海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元存在PCT陽性表達(dá)。3.LPS腦內(nèi)注射誘導(dǎo)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多,伴有Gas1表達(dá)升高。4.體外單純LPS刺激對星形膠質(zhì)細(xì)胞活力無明顯作用,LPS+IFNγ+TNFα聯(lián)合刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞氧化應(yīng)激水平明顯升高,細(xì)胞凋亡增多,細(xì)胞生長周期阻滯,伴有Gas1表達(dá)升高。5.si RNA敲低活化星形膠質(zhì)細(xì)胞Gas1表達(dá)水平,導(dǎo)致LPS+IFNγ+TNFα聯(lián)合刺激下星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡減少,但是細(xì)胞周期阻滯無明顯改善。6.Gas1通過增高活化星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl2比例,激活caspase-3的表達(dá)促進(jìn)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡,對炎性信號(hào)通路、細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)無明顯作用。【結(jié)論】1.證明了大鼠及人腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞PCT的表達(dá),在LPS及肺炎鏈球菌刺激下活化星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)PCT明顯增多,CSF PCT含量升高,提示PCT可能是腦內(nèi)細(xì)菌感染診斷標(biāo)志物(Figure 1)。2.發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥中活化星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡增多,細(xì)胞周期阻滯,伴有Gas1表達(dá)升高,說明了活化星形膠質(zhì)細(xì)胞通過凋亡及細(xì)胞增殖阻滯的方式減少細(xì)胞數(shù)目。3.明確了Gas1在活化星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡中的作用,干擾Gas1的表達(dá)可以導(dǎo)致活化星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡減少,但是細(xì)胞周期阻滯無明顯改善,提示Gas1可以作為調(diào)控活化星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而改變神經(jīng)炎癥網(wǎng)絡(luò)程度,減少BM患者認(rèn)知功能損害等后遺癥的潛在靶點(diǎn)。4.闡明了Gas1促使活化星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,即通過增高Bax/Bcl2的比例,激活caspase-3的表達(dá)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡(Figure 1)。Figure 1細(xì)菌感染誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化與死亡的模式圖。細(xì)菌/細(xì)菌成分LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化,釋放PCT增多,CSF PCT含量升高,是腦內(nèi)細(xì)菌感染潛在診斷標(biāo)志物�；罨切文z質(zhì)細(xì)胞Gas1表達(dá)升高,上調(diào)Bax/Bcl2,激活caspase-3,誘導(dǎo)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡增多。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R741
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本文編號(hào)：2278535