【摘要】：第一部分IL-17A在缺血性腦卒中(CIS)恢復(fù)期的表達(dá)變化以及神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的影響 目的：確定CIS后IL-17A的時間與空間表達(dá)趨勢,以及明確IL-17A是否可促進(jìn)CIS后神經(jīng)再生與功能恢復(fù)。 方法：成年雄性IL-17A敲除(IL-17A knock-out,il-17a-/-)或野生型(wide-type, WT)小鼠大腦中動脈栓塞,缺血60分鐘后再灌注。野生型小鼠從CIS后14天開始,連續(xù)14天經(jīng)鼻腔給予重組白介素17A蛋白(recombinant IL-17A, rIL-17A)或溶劑對照(vehicle),或者經(jīng)側(cè)腦室給予小鼠IL-17A中和抗體(anti-IL-17A mAb)或IgG1同型對照抗體。CIS后27天腹腔注射BrdU,間隔8個小時,16小時后灌注取材檢測祖細(xì)胞增殖活性。CIS后7天腹腔注射BrdU,間隔8個小時候再次注射一次,連續(xù)注射7天,35天灌注取材檢測祖細(xì)胞壽命。CIS后1、3、7、14、21、28、42或70天免疫印跡和實(shí)時定量PCR檢測缺血側(cè)大腦半球IL-17A的表達(dá)。CIS后7、14、21或28天免疫熒光和免疫印跡檢測腦室下區(qū)(subventricular zone, SVZ)和海馬區(qū)IL-17A的表達(dá)。CIS后28或35天免疫細(xì)胞化學(xué)染色溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU),Ki67,磷酸化組蛋白H3(phospho-histone H3, PH3),雙皮質(zhì)素(doublecortin, DCX)。CIS后35天免疫細(xì)胞化學(xué)檢測β3-tubulin和突觸素(synaptophysin);免疫印跡檢測突觸小體相關(guān)蛋白-25(synaptosomal-associated protein-25kDa, SNAP-25);以及小鼠行為學(xué)評分。 結(jié)果：免疫印跡和實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比,CIS后7、14、21和28天缺血側(cè)大腦半球IL-17A的基因與蛋白表達(dá)水平顯著升高,28天達(dá)峰值。缺血側(cè)SVZ和紋狀體區(qū)IL-17A陽性細(xì)胞數(shù)在CIS后7、14、21和28天顯著增加。CIS后28天,抑制IL-17A可顯著減少紋狀體BrdU+/DCX+細(xì)胞數(shù),而rIL-17A可顯著增加紋狀體BrdU+/DCX+細(xì)胞數(shù)。然而抑制IL-17A或rIL-17A不影響CIS后28天SVZ區(qū)BrdU+、Ki67+或PH3+細(xì)胞數(shù)。CIS后35天,抑制IL-17A顯著減少缺血側(cè)SVZ區(qū)BrdU+、 BrdU+/DCX+細(xì)胞數(shù),顯著減少紋狀體BrdU+/DCX-細(xì)胞數(shù),而rIL-17A則增加缺血側(cè)SVZ區(qū)BrdU+、BrdU+/DCX+細(xì)胞數(shù),顯著增加紋狀體BrdU+/DCX+6細(xì)胞數(shù)。抑制IL-17A還可顯著減少缺血側(cè)紋狀體BrdU+/pⅢ-tubulin+細(xì)胞數(shù),減少SNAP-25和synaptophysin的表達(dá),顯著抑制CIS后神經(jīng)功能的恢復(fù),rIL-17A可顯著增加BrdU+/βⅢ-tubulin+細(xì)胞數(shù),增加SNAP-25和synaptophysin的表達(dá),顯著促進(jìn)CIS后神經(jīng)功能的恢復(fù)。 結(jié)論：CIS恢復(fù)期在SVZ和紋狀體區(qū)升高的IL-17A可顯著增加SVZ區(qū)神經(jīng)祖細(xì)胞壽命,促進(jìn)神經(jīng)元分化和突觸再生,從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。 第二部分p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/calpain1信號通路在CIS后IL-17A的促神經(jīng)再生中的作用 目的：探討白介素17A促進(jìn)CIS后神經(jīng)再生的分子生物學(xué)機(jī)制。 方法：WT小鼠大腦中動脈栓塞,缺血60分鐘后再灌注。小鼠從CIS后14天開始,連續(xù)14天經(jīng)鼻腔給予重組白介素17A蛋白(recombinant IL-17A, rIL-17A)或溶劑對照(vehicle),或者經(jīng)側(cè)腦室給予小鼠IL-17A中和抗體(anti-IL-17A mAb)或IgG1同型對照抗體。CIS后27天腹腔注射BrdU,間隔8個小時,16小時后灌注取材檢測祖細(xì)胞增殖活性。其中部分小鼠在鼻腔給予rIL-17A前30分鐘腹腔給予p38通路抑制劑SB203580或1%DMSO,或者經(jīng)側(cè)腦室給予calpain1抑制劑PD151746或1%DMSO。CIS后28天免疫印跡檢測IL-17A,磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phospho-extracellular regulated protein kinase, p-ERK),磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phospho-c-Jun N-terminal kinase, p-JNK),磷酸化AKT(p-AKT),磷酸化p38(p-p38),all-spectrin, calpain1和calpain2的蛋白表達(dá)。CIS后35天免疫細(xì)胞化學(xué)染色BrdU、 DCX、β3-tubulin和突觸素(synaptophysin);免疫印跡檢測SNAP25。 結(jié)果：IL-17A敲除,中和抗體中和IL-17A或rIL-17A干預(yù)均不影響CIS后28天缺血側(cè)腦組織p-ERK,p-JNK, p-AKT和calpain2的蛋白表達(dá)；抑制IL-17A顯著減少缺血側(cè)腦組織p-p38蛋白表達(dá)；而rIL-17A干預(yù)顯著增加p-p38蛋白表達(dá)。IL-17A敲除,中和抗體中和IL-17A可顯著增加CIS后28天總calpain和calpain1的活性,而rIL-17A干預(yù)則顯著抑制總calpain和calpain1的活性。SB203580可顯著增加CIS后28天缺血側(cè)腦組織calpain1活性。提前加入SB203580則可阻斷IL-17A對總calpain和calpain1活性的抑制作用。然而PD151746則對IL-17A和p-p38的蛋白表達(dá)無顯著影響。PD151746干預(yù)可顯著增加CIS后35天缺血側(cè)紋狀體BrdU+/DCX+和BrdU+/β3-tubulin+細(xì)胞數(shù),也顯著增加synaptophysin和SNAP25的表達(dá)。 結(jié)論：IL-17A通過p38MAPK/calpain1信號通路促進(jìn)CIS后神經(jīng)再生。 第三部分IL-17A在CIS后的細(xì)胞來源以及分泌機(jī)制 目的：明確IL-17A在CIS恢復(fù)期的細(xì)胞來源,以及探討其細(xì)胞分泌機(jī)制。 方法：WT小鼠大腦中動脈栓塞,缺血60分鐘后再灌注。CIS后28天免疫熒光雙染IL-17A和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP,神經(jīng)元標(biāo)記NeuN或小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記Iba-1。CIS后14天缺血側(cè)SVZ區(qū)提取的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),100ng/ml脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)干預(yù)后免疫熒光和免疫印跡分別檢測細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)上清液中IL-17A的蛋白表達(dá)；p38MAPK特異性抑制劑SB203580或1%DMSO在LPS干預(yù)前30分鐘加入原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中。 結(jié)果：在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IL-17A與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP共表達(dá),而不與小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記Iba-1或神經(jīng)元標(biāo)記NeuN共表達(dá)。體外培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LPS可顯著增加細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)上清液中IL-17A的蛋白表達(dá);而加入SB203580后,LPS對細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)上清液中IL-17A的表達(dá)促進(jìn)作用顯著被抑制。 結(jié)論：星形膠質(zhì)細(xì)胞是CIS恢復(fù)期IL-17A的主要細(xì)胞來源；星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-17A依賴于p38MAPK信號通路。 第四部分IL-17A對體外培養(yǎng)的SVZ區(qū)神經(jīng)祖/干細(xì)胞的增殖和分化的影響及其作用機(jī)制 目的：研究IL-17A對體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)干/祖細(xì)胞(neural stem/progenitor cells, NSCs)的增殖分化的影響,并探討其作用機(jī)制。 方法：成年雄性IL-17A敲除(IL-17A knock-out, il-17a-/-)或野生型(wide-type, WT)小鼠大腦中動脈栓塞,缺血60分鐘后再灌注。CIS后-14天分離缺血側(cè)SVZ區(qū)NSCs培養(yǎng)。第二代神經(jīng)球接種后增殖,WT小鼠CIS后來源的第二代NSCs增殖液中連續(xù)7天給予0、10、50和100ng/ml rIL-17A干預(yù)后24小時計數(shù)神經(jīng)球數(shù)量；收集細(xì)胞接種后分化,加入BrdU后16小時免疫熒光檢測BrdU陽性細(xì)胞的比例。來源于il-17a-/-小鼠的第二代NSCs分化后7天,以及rIL-17A(0、10、50和100ng/ml)或活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清(加或不加anti-IL-17A mAb)干預(yù)的WT小鼠第二代NSCs分化后7天,免疫熒光雙染β3-tubulin和GFAPc IL-17A中和抗體(anti-IL-17A mAb)或IgG1同型對照抗體與rIL-17A于分化開始后2小時同時加入分化液中。p38MAPK特異性抑制劑SB203580在干預(yù)前30分鐘加入分化液中。第二代NSCs分化后2小時加入calpain1特異性抑制劑PD151746,連續(xù)給7天。免疫印跡檢測p-p38, calpain1和calpain2的蛋白表達(dá)。 結(jié)果：IL-17A敲除后NSCs分化為β3-tubulin陽性神經(jīng)元顯著減少；10或50ng/ml rIL-17A干預(yù)或者活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞上清干預(yù)后NSCs分化為β3-tubulin陽性神經(jīng)元顯著增加,而分化為GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著減少。Anti-IL-17A mAb顯著阻斷活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞上清對NSCs神經(jīng)元分化的促進(jìn)作用。給予rIL-17A顯著增加p-p38蛋白表達(dá)和calpain1活性。rIL-17A對p-p38蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用以及對calpain1活性的抑制作用可被anti-IL-17A mAb顯著阻斷。預(yù)先給予SB203580顯著阻斷rIL-17A對calpain1活性的抑制作用；而PD151746對p-p38蛋白表達(dá)無顯著影響。PD151746顯著增加NSCs 分化為β3-tubulin+神經(jīng)元而減少GFAP+星形膠質(zhì)細(xì)胞。 結(jié)論：IL-17A通過p38MAPK/calpain1信號通路促進(jìn)體外培養(yǎng)的原代NSCs的神經(jīng)元分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3

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本文編號：2252069