【摘要】：目的:建立體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)并加以鑒定,利用相關(guān)化學(xué)試劑的誘導(dǎo)分化作用,誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細胞方向分化。以BMSCs為研究對象,實驗驗證亞低溫通過上調(diào)BMSCs中SUMO化修飾水平增加細胞本身對缺血缺氧的耐受性。制備動物腦梗死模型,給予亞低溫聯(lián)合缺血半暗帶BMSCs移植,驗證亞低溫通過上調(diào)細胞內(nèi)SUMO化修水平飾改善腦梗死模型大鼠的神經(jīng)功能。本研究旨在實驗驗證亞低溫通過上調(diào)SUMO化修飾發(fā)揮細胞保護作用,旨在為探索亞低溫聯(lián)合干細胞移植治療腦梗死打下理論和實驗基礎(chǔ)。方法:選擇改良后的原代細胞貼壁法對提取的SD大鼠BMSCs進行培養(yǎng),然后再用流式細胞術(shù)檢測鑒定細胞表面標記蛋白,利用化學(xué)試劑法體外誘導(dǎo)其向神經(jīng)細胞分化;在33℃和37℃兩種溫度條件下培養(yǎng)BMSCs,之后運用Western blotting方法對在不同的溫度培養(yǎng)下BMSCs內(nèi)的SUMO1和SUMO 2/3蛋白表達情況進行檢測,細胞免疫熒光染色法檢測SUMO1和SUMO2/3蛋白在細胞內(nèi)的定位變化;利用RNA干擾沉默技術(shù)(siRNA)制備UBC9敲低的BMSCs(SiUBC9BMSCs),建立野生BMSCs和SiUBC9 BMSCs的氧糖剝奪(OGD)模型并分別給予常溫37℃和亞低溫33℃干預(yù),Western blotting方法檢測不同細胞分組和不同溫度培養(yǎng)條件下SUMO1和SUMO2/3蛋白表達水平變化,檢測每組細胞凋亡率變化和培養(yǎng)基中LDH濃度變化;線栓法建立SD大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型,亞低溫33℃聯(lián)合BMSCs或SiUBC9 BMSCs梗死缺血半暗帶區(qū)移植,觀察大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況,盲法實施神經(jīng)功能評價。結(jié)果:利用改良后的細胞貼壁法獲取到體外培養(yǎng)大鼠BMSCs后,流式細胞術(shù)檢測所培養(yǎng)細胞滿足BMSCs相關(guān)特征,在體外化學(xué)試劑誘導(dǎo)下,體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs能夠表達神經(jīng)膠質(zhì)細胞標記蛋白以及神經(jīng)元表面標記蛋白;Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)亞低溫培養(yǎng)條件下SUMO1和SUMO2/3結(jié)合蛋白表達水平升高,細胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)亞低溫干預(yù)后SUMO1和SUMO2/3出現(xiàn)明顯的細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移;OGD處理BMSCs后,Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)亞低溫可明顯促進SUMO1和SUMO2/3結(jié)合蛋白表達水平的升高,減少細胞凋亡率和LDH分泌,發(fā)揮出神經(jīng)保護作用,這種細胞保護作用為SUMO依賴性的;成功制備大鼠腦梗死模型,亞低溫條件下可增加移植到缺血半暗帶BMSCs的存活率,亞低溫聯(lián)合BMSCs移植治療可明顯促進腦梗死后大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。結(jié)論:1.BMSCs在細胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)下,可部分地表達神經(jīng)元特異性蛋白NSE,大部分細胞表達神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志蛋白GFAP。2.亞低溫增加BMSCs中SUMO1和SUMO2/3與靶蛋白的結(jié)合,誘發(fā)SUMO漿核移位;SiUBC9抑制SUMO1和SUMO2/3在細胞乏氧狀態(tài)下與靶蛋白的結(jié)合;亞低溫可降低BMSCs在乏氧狀態(tài)下的細胞凋亡比率和LDH分泌水平,發(fā)揮細胞保護作用,且這種作用為SUMO依賴性。3.亞低溫聯(lián)合BMSCs缺血半暗帶移植能夠提高移植區(qū)細胞的存活率,保護缺血半暗帶區(qū)受損神經(jīng)元,改善受損的神經(jīng)功能,且這種作用為SUMO依賴性。4.亞低溫對乏氧狀態(tài)下BMSCs的保護作用與細胞內(nèi)大量蛋白的SUMO化修飾密不可分,由此推測,增強靶蛋白SUMO化修飾可能是亞低溫腦保護作用的分子機制之一。
[Abstract]:AIM: To establish and identify bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) cultured in vitro, and to induce BMSCs to differentiate into neural cells by inducing differentiation with related chemical reagents. Cerebral infarction model was induced by mild hypothermia combined with ischemic penumbra BMSCs transplantation to verify that mild hypothermia can improve the neurological function of cerebral infarction model rats by up-regulating the level of intracellular SUMO modification. Methods: BMSCs of SD rats were cultured by modified primary cell adherence method, then identified by flow cytometry, and induced to differentiate into neurons by chemical reagent method in vitro. BMSCs were cultured at 33 C and 37 C. Western blotting was used to detect the expression of SUMO1 and SUMO2/3 proteins in BMSCs cultured at different temperatures, immunofluorescence staining was used to detect the localization of SUMO1 and SUMO2/3 proteins in cells, and RNA interference silencing (siRNA) was used to prepare UBC9 knockdown BMSCs (SiUBC9BMSCs) to establish wild BMSCs and SiUBC9BMs. The expression of SUMO1 and SUMO2/3 protein was detected by Western blotting. The apoptosis rate and LDH concentration in the medium of SD rats were detected by thread embolization method. Embolization (MCAO) model was established by mild hypothermia combined with BMSCs or SiUBC9 BMSCs transplantation in ischemic penumbra to observe the recovery of nerve function in rats and evaluate the nerve function blindly. Western blotting showed that the expression of SUMO1 and SUMO2/3 binding proteins was elevated under mild hypothermia, and the expression of SUMO1 and SUMO2/3 binding proteins was detected by immunofluorescence staining. After OGD treatment of BMSCs, Western blotting showed that mild hypothermia could significantly promote the expression of SUMO1 and SUMO2/3 binding protein, reduce the apoptosis rate and LDH secretion, and play a neuroprotective role, which was SUMO-dependent. The rat model of cerebral infarction was successfully prepared with mild hypothermia strips. BMSCs transplanted into ischemic penumbra can increase the survival rate of BMSCs, mild hypothermia combined with BMSCs transplantation can significantly promote the recovery of neural function in rats after cerebral infarction. Conclusion: 1. BMSCs can partially express neuron-specific protein NSE under the induction of cell-conditioned medium, and most cells express glial cell marker protein GFAP.2. Hypothermia increased the binding of SUMO 1 and SUMO 2/3 to target proteins in BMSCs and induced SUMO nucleus translocation; SiUBC9 inhibited the binding of SUMO 1 and SUMO 2/3 to target proteins under hypoxic conditions; and mild hypothermia decreased the apoptosis rate and LDH secretion level of BMSCs under hypoxic conditions, and this effect was SUMO-dependent.3. Temperature combined with BMSCs transplantation in ischemic penumbra can improve the survival rate of transplanted cells, protect the damaged neurons in ischemic penumbra and improve the impaired nerve function. This effect is SUMO-dependent. 4. The protective effect of mild hypothermia on BMSCs in hypoxic state is closely related to the SUMO modification of a large number of intracellular proteins, which may enhance the target. Protein SUMO modification may be one of the molecular mechanisms of mild hypothermia brain protection.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.3

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本文編號：2204220