發(fā)布時間：2018-07-16 19:55

【摘要】：目的:1.為了驗證miR-23b海綿表達慢病毒載體對miR-23b的表達水平、miR-23b靶蛋白VHL相關(guān)的下游信號通路和膠質(zhì)母細胞瘤細胞體內(nèi)外促血管生成、侵襲及遷移能力的抑制作用。2.為了探索SNORD76與HOTAIR表達改變之間的關(guān)系、在膠質(zhì)母細胞瘤中的功能及可能的作用機制、過表達SNORD76對膠質(zhì)母細胞瘤裸鼠原位模型的影響及SNORD76在不同級別膠質(zhì)瘤臨床標本中的表達情況。方法:1.用表達miR-23b海綿的慢病毒載體感染膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87-MG、LN229和U251后,利用定量PCR檢測細胞內(nèi)miR-23b表達水平變化、Western blot技術(shù)檢測VHL及其下游信號通路蛋白的表達變化,采用體外血管形成模擬實驗、Transwell實驗及劃痕實驗分別檢測膠質(zhì)母細胞瘤促血管形成、侵襲和遷移相關(guān)惡性表型的變化。2.建立膠質(zhì)母細胞瘤U87-MG裸鼠原位瘤模型,利用小動物活體成像系統(tǒng)實時監(jiān)測原位移植瘤的生長速度,免疫組織化學(xué)染色檢測VHL及其下游信號通路蛋白的表達變化、CD31染色檢測新生血管情況及HE染色檢測腫瘤組織向非腫瘤組織侵襲或遷移的情況。3.利用定量PCR技術(shù)分別檢測實驗室常規(guī)培培養(yǎng)細胞系U87-MG、U87-EGFRv III、LN229、U251和SNB19中HOTAIR、SNORD76和GAS5的基礎(chǔ)表達水平,利用表達HOTAIR si RNA和全長序列慢病毒載體分別感染高表達和低表達HOTAIR的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系后,檢測HOTAIR、SNORD76和GAS5的表達變化。4.分別對低表達和高表達SNORD76的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系采用SNORD76過表達慢病毒處理和SNORD76 si RNA處理后,分別利用MTT實驗和軟瓊脂克隆形成實驗檢測膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖能力的改變。5.利用PI染色流式細胞學(xué)技術(shù)檢測過表達SNORD76對細胞周期的影響,隨后Western blot技術(shù)檢測細胞周期相關(guān)蛋白的改變。6.建立SNORD76過表達組和對照組的U87-MG裸鼠膠質(zhì)母細胞瘤原位模型,利用小動物成像系統(tǒng)監(jiān)測原位移植瘤的生長情況,利用免疫組織化學(xué)染色檢測相關(guān)蛋白的表達變化。7.定量PCR技術(shù)檢測WHO分級II級膠質(zhì)瘤標本20例、III級22例和IV級(膠質(zhì)母細胞瘤)21例中SNORD76和GAS5的表達情況。結(jié)果:1.定量PCR結(jié)果顯示在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中表達miR-23b海綿慢病毒可以抑制~50%的miR-23b表達,而Western blot結(jié)果顯示與血管生成(VEGFA和HIF-1α)、侵襲和遷移(β-catenin、ZEB1、MMP2及MMP9)相關(guān)蛋白表達減少,而與侵襲和遷移能力負相關(guān)的蛋白VHL和E-cadherin表達增加,體外功能實驗結(jié)果提示miR-23b海綿表達慢病毒抑制膠質(zhì)母細胞瘤促血管生成、侵襲和遷移能力。2.小動物活體成像結(jié)果證明miR-23b海綿處理組原位移植瘤的生長速度較慢而裸鼠平均生存期較長,免疫組織化學(xué)染色顯示CD31染色陽性新生血管的數(shù)量減少及腫瘤細胞向正常腦組織侵襲和遷移的細胞少,腫瘤與非腫瘤組織交界處較平滑,并且差異表達蛋白檢測結(jié)果同Western blot結(jié)果。3.HOTAIR過表達組細胞中SNORD76表達減少,而HOTAIR si RNA處理組中SNORD76表達增加,GAS5的表達水平可能不受HOTAIR表達改變的影響。4.MTT實驗和軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果表明,過表達SNORD76抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖而敲低SNORD76表達后促進膠質(zhì)母細胞瘤增殖,過表達SNORD76的膠質(zhì)母細胞瘤細胞出現(xiàn)細胞周期S期阻滯,而進一步用Western blot檢測細胞周期相關(guān)蛋白變化后發(fā)現(xiàn)Rb、p Rb表達增加而cyclin A1、cyclin B1及p107表達降低。5.膠質(zhì)母細胞瘤U87-MG裸鼠原位模型實驗結(jié)果表明,過表達SNORD76處理組原位瘤增大較對照組慢而裸鼠生存期較長,HE染色結(jié)果說明處理組腫瘤組織較對照組小,免疫組織化學(xué)檢測細胞周期相關(guān)蛋白表達變化與Western blot中變化一致。6.定量PCR技術(shù)檢測了不同級別膠質(zhì)瘤臨床標本結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAS5的表達在不同級別膠質(zhì)瘤中沒有統(tǒng)計學(xué)差異,而SNORD76在膠質(zhì)母細胞瘤中特異性低表達。結(jié)論:1.miR-23b海綿通過提高miR-23b靶點蛋白VHL表達進而抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的促血管生成、侵襲和遷移能力。2.體內(nèi)實驗中過表達miR-23b海綿抑制膠質(zhì)母細胞瘤U87-MG原位移植瘤的生長。3.膠質(zhì)母細胞瘤細胞中SNORD76表達與HOTAIR表達水平改變呈負相關(guān)的關(guān)系。4.過表達SNORD76可能是通過Rb相關(guān)周期調(diào)控通路使膠質(zhì)母細胞瘤細胞發(fā)生細胞周期S期阻滯。5.過表達SNORD76抑制膠質(zhì)母細胞瘤U87-MG原位移植瘤的增殖能力。6.臨床標本中SNORD76表達降低提示腫瘤惡性程度更高。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of miR - 23b in human glioma cell line U87 - MG , U87 - EGFRv III , LN229 , U251 and SNB by quantitative PCR . The results showed that the expression of SNORD76 inhibited the proliferation of glioma cells . The results showed that overexpression of SNORD76 inhibited the proliferation of glioma cells and decreased the expression of cyclin A1 , cyclin B1 and p107 .
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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本文編號：2127506