本文選題：腦 + 糖尿病/高血糖　； 參考：《寧夏醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：目的觀察糖尿病/高血糖狀態(tài)腦缺血后，微血管數量、形態(tài)和內皮細胞的結構改變，明確微血管改變在糖尿病/高血糖加重腦缺血損傷中的作用及可能的機制，進一步探討糖尿病/高血糖加重腦缺血損傷的可能機制。 方法本實驗選取雄性SD大鼠（260-300g），隨機分成糖尿病腦缺血組（DM組）、糖尿病假手術組（DS組）、正常血糖腦缺血組（NM組）和正常血糖假手術組（NS組），腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）制備1型糖尿病大鼠模型，血糖恒定高于16.7mol/ml為模型成功；正常血糖組給予等體積生理鹽水腹腔注射。大腦中動脈阻塞（MCAO）法制備局灶性腦缺血模型（缺血30min）。再灌注1d，3d，7d，14d，28d時，采用Longa評分法進行大鼠神經功能評分后斷頸取腦；取前囟前2mm至前囟后3mm間腦組織行連續(xù)冠狀取材（厚3mm），將腦組織片于4%多聚甲醛固定用于ＨＥ和免疫組化染色；梗死區(qū)周邊大腦皮質取材，-80℃凍存，用于western-blotting檢驗，同時，提取相應區(qū)域腦組織置于2.5％戊二醛固定，用于電鏡檢查。 HE和PAS染色觀察腦缺血后不同灌注時間微小血管的損傷和再生；透射電子顯微鏡觀察腦缺血再灌注1d、3d、7d時血管內皮細胞和基底膜的形態(tài)學改變；連同內皮細胞功能蛋白vWF免疫組化染色，共同觀察缺血再灌注過程中微小血管的損傷和再生情況。免疫組化和western-blotting法檢測缺血再灌注不同時段各組缺血周邊區(qū)VEGF和VEGFR2的表達，并進一步將VEGF和星形膠質細胞特異性標記GFAP和神經元特異性標記NeuN分別進行免疫組化熒光雙標，進一ki明確VEGF神經細胞定位。從而，進一步闡明糖尿病/高血糖對腦缺血再灌注微小血管影響的可能分子機制，為高血糖加重腦缺血損傷的防治提供新思路。 結果高血糖組梗死灶體積明顯大于正常血糖組（P＜0.05）。組織學觀察結果顯示：假手術組結構基本正常，MACO30min再灌注1d時，缺血側血管管腔增大，血管和神經細胞周圍間隙增大。缺血區(qū)出現神經元腫脹，部分神經元出現核固縮，DM組以上腦水腫和神經細胞損傷的表現更加明顯。再灌注3d時，以上腦水腫程度減輕，缺血灶邊緣微小血管數量增加，管腔大而不規(guī)則；再灌注7d時，血管數量較3d減少，形狀逐漸恢復正常，缺血灶膠質細胞大量堆積，膠質結節(jié)形成；至再灌注28d時，缺血區(qū)血管無論數量或形態(tài)，與正常組比較，無明顯差異。與NM組相比較，DM組缺血側微小血管的隨再灌注時間的延長，數量變化趨勢相似，但再灌注3d和7d時，缺血側邊緣血管數量明顯增多，再生的血管呈簇狀排列，部分血管管壁缺如，結構不良。PAS結果顯示：再灌注1d時血管管腔變大，基底膜變薄，較正常染色變淺，3d時，再生的血管形狀不規(guī)則，基底膜染色淺，部分基底膜斷裂，7d時基底膜開始增生、部分區(qū)域變厚，染色較1d、3d加重；再灌注14d時，血管基本恢復，基底膜較正常血管略增厚，基底膜相對完整，PAS染色加深。與NM組相比較，DM組再灌注1d時，基底膜PAS染色明顯變淡，基底膜厚薄不一現象明顯，有些區(qū)域甚至出現染色不連續(xù)。再灌注7d后，血管形狀多數不規(guī)則，基底膜染色淡，部分區(qū)域缺如。電子顯微鏡觀察可見，DM組和NM組血管內皮細胞均出現不同程度的受損情況。在DM1d時，內皮細胞形成凋亡小體，基底膜內出現大量空泡；再灌注3d時，新生血管管腔不規(guī)則，基底膜厚薄不一；再灌注7d時，血管壁呈增生樣增厚，血管周邊空泡較1、3d組明顯減少。血管壁的內皮細胞和構成血管壁的星形膠質在缺血再灌注1d時，細胞明顯水腫，內質網和線粒體明顯腫脹，甚至出現細胞器崩解，以后逐漸恢復。高血糖組血管內皮的受損情況較NM明顯加重，血管壁周邊空泡明顯增多、變大，內皮細胞凋亡明顯，，基底膜厚薄不一更加明顯，其內空泡大而易見，甚至出現基底膜斷裂，損傷表現以再灌注1d最為明顯。DM組缺血后內皮細胞和星形膠質細胞細胞器損傷同樣明顯加重。內皮細胞功能蛋白vWF免疫組化結果顯示：假手術組內皮細胞內可見vWF均勻高強度表達，在NM組1d時，表達明顯下降，再灌注3d和7d時血管內皮細胞又出現不同程度表達，至缺血再灌注28d后，血管內皮陽性表達量恢復至正常狀態(tài)。與NM組比較，DM組各灌注時間點內皮細胞vWF表達明顯減弱。免疫組化結果顯示：VEGF主要定位于微小血管內皮細胞和神經細胞胞漿，VEGFR2主要定位于內皮細胞。假手術組鼠腦中僅見微量VEGF表達，DM組和NM組腦組織VEGF陽性表達主要分布于缺血周邊區(qū),VEGFR2陽性表達主要分布于缺血周邊區(qū)的血管內皮細胞。NM組和DM組大鼠腦組織中VEGF表達均較正常對照組明顯增加(P0.05)。VEGF表達于再灌注1d開始升高，至3d達到高峰，隨后逐漸降低，隨時間延長其表達逐漸減少；至第28天僅有少量表達。與NM組相比，DM各灌注組VEGF陽性表達明顯降低(P0.05)。Western Blotting結果顯示：VEGF和VEGFR2蛋白于正常血糖腦缺血再灌注組及假手術組表達較少，自第3d有一定量的表達，第7天表達最多，之后逐漸減少，至28天仍有表達（P0.05）。通過VEGF和GFAP和Neun免疫組化熒光雙標結果提示，VEGF在星形膠質細胞和神經元均有高表達。 結論 1.糖尿病/高血糖能加重腦組織損傷，加大梗死灶面積及微小血管損傷；微小血管損傷包括：內皮細胞損傷，基底膜損傷和星形膠質細胞的損傷，參與了糖尿病/高血糖加重腦缺血損傷； 2.糖尿病/高血糖可促進缺血再灌注過程中微小血管增生，但增生的血管呈簇狀生長，結構不完整，可能與糖尿病/高血糖狀態(tài)，腦缺血預后不良有關； 3.腦缺血再灌注損傷可誘導VEGF、VEGFR2的早期表達，參與了腦缺血損傷微小血管的再生； 4.糖尿病/高血糖狀態(tài)腦再灌注損傷時VEGF和VEGFR-2蛋白表達量的減少，可能參與了糖尿病/高血糖導致的再灌注過程中再生微小血管的結構不良。
[Abstract]:Objective To observe the changes of the number , morphology and structure of endothelial cells after cerebral ischemia in diabetes / hyperglycemia , and to clarify the role and possible mechanism of microvascular changes in diabetic / hyperglycemia patients with cerebral ischemia injury , and to further explore the possible mechanism of diabetes / hyperglycemia to aggravate cerebral ischemia injury .

Methods Male SD rats ( 260 - 300 g ) were randomly divided into diabetic cerebral ischemia group ( DM group ) , diabetic pseudo - operation group ( DS group ) , normal blood glucose cerebral ischemia group ( NM group ) and normal blood glucose pseudo - operation group ( NS group ) .
Normal blood glucose group was injected intraperitoneally with equal volume of physiological saline . The focal cerebral ischemia model ( ischemia 30min ) was prepared by middle cerebral artery occlusion ( occlusion ) . After reperfusion for 1d , 3d , 7d , 14d and 28d , the rats were divided into the brain by Longa scoring method .
The brain tissue was treated with 4 % polyformaldehyde for HE and immunohistochemical staining after taking the anterior fontanel 2 mm to the anterior fontanel 3 mm from the anterior fontanel and 3 mm from the anterior fontanel .
The cerebral cortex was taken from the periphery of the infarct area and frozen at -80 鈩

本文編號：2045447