本文選題：海洛因 + 白質腦病��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景 海洛因海綿狀白質腦病(Heroin spongiform leukoencephalopathy, HSLE)是海洛因成癮患者中出現(xiàn)的一種比較少見的疾病,它由荷蘭人Wolters等于1982年在阿姆斯特丹首次報道；此后,海洛因濫用致使神經系統(tǒng)的受損愈來愈受到國內人們的重視。近年來,國內學者已對海洛因白質腦病的臨床、影像、腦脊液、基因多態(tài)性、病理等方面做了深入的研究,并對該病的流行病學及病因學進行了初步研究。研究發(fā)現(xiàn)本病患者主要發(fā)生于燙吸海洛因的這一特定吸毒人員中,并具有以下典型的臨床特征：1、均具有燙吸海洛因史,曾有過戒毒；2、急性或亞急性起��；3、以小腦損害為首發(fā)臨床表現(xiàn),進一步可累及椎體外系和錐體系；4、影像學顯示在腦白質區(qū)出現(xiàn)對稱蝴蝶樣或類圓形的病灶,為這類患者最具特點的損害,主要分布在小腦半球、腦干、內囊后肢等；5、臨床治療上,能量合劑效果較好,激素沖擊無明顯療效。 目前認為海洛因腦病為中毒性腦病的其中之一,與其它臨床上常見的中毒性白質腦病有著比較相似的影像學變化,但其發(fā)病機制不清楚,而海洛因海綿狀白質腦病發(fā)病機制的知曉不僅有利于提高本病治療效果,更重要的是可以為其它中毒性白質腦病的致病機制提供借鑒和啟示。由于該病較少見,病理資料缺少,病例搜集難度大,病因及發(fā)病機制研究難度相對較大。目前國內外的研究絕大多數都局限于臨床資料的整理及分析,病因和發(fā)病機制研究仍為空白。但總結過去研究發(fā)現(xiàn)： 頭顱核磁共振波譜分析顯示,通過觀察額葉、頂葉、枕葉白質中的肌酸、膽堿、乳酸、N-乙酰天門冬氨酸等物質代謝水平,發(fā)現(xiàn)病變部位的N-乙酰天門冬氨酸、膽堿、N-乙酰天門冬氨酸/肌酸、膽堿/肌酸等均低于對照組,而乳酸含量與對照組相比升高。且該病患者腦部的病灶周圍影像尚未發(fā)生改變的部位已經有物質代謝改變,也就是說腦部物質代謝變化部位大于病變范圍,但未見乳酸波。從上可知,海洛因腦病患者病變腦組織乳酸含量較對照組升高,提示本病可能存在腦組織有氧代謝障礙,導致需加大通過糖酵解途徑使葡萄糖降解生成ATP,為大腦提供部分能量,從而導致病變部位的腦組織乳酸含量增多。 腦組織病理學研究顯示,對腦標本進行常規(guī)固定、剛果紅染色、蘇木素-伊紅染色、髓鞘染色等,HE染色發(fā)現(xiàn)中樞神經系統(tǒng)白質病變區(qū)有較多大小不一的空泡形成,海綿狀改變；髓鞘染色可見白質區(qū)大量空泡退行性變,呈串珠樣；電鏡下發(fā)現(xiàn)少突膠質細胞較多空泡形成,線粒體腫脹,內質網擴張,髓鞘有較多空泡。從而得出白質廣泛的脫髓改變是少突膠質細胞受損繼發(fā)的髓鞘損害而不是由毒物直接損害髓鞘。 臨床對照研究顯示,通過將20例HSLE患者分為兩組,一組予維生素B族藥物及輔酶Q10治療,另一組予再這基礎上加上地塞米松20mg/d,連續(xù)用10天后逐漸減量至停藥,對比兩組患者治療前后1月、半年、1年癥狀變化情況,兩組治療后癥狀均比治療前好轉,但是兩組改善情況無顯著差異。說明對能量合劑以及抗氧化治療是目前有效的治療手段,提示該病可能與線粒體能量代謝障礙有關[13]。 細胞色素CYP2D6基因多態(tài)性與海洛因海綿狀白質腦病易感性的關系研究發(fā)現(xiàn),CYP2D6/C188、CYP2D6/G4268、CYP2D6/L2938等基因的突變率高于正常人體,且有學者曾研究發(fā)現(xiàn)該基因與暴露在環(huán)境毒物中的中毒性腦病增加及帕金森病的危險性增高有一定聯(lián)系,推測細胞色素CYP2D6與海洛因腦病有一定的關系。線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ相關基因研究,通過對13513GA突變位行RFLP分析測定,發(fā)現(xiàn)野生型在Mbol限制核酸內切酶下,被切割成144、170、26bp三個片段,然而突變型由于缺少酶切位點不被完全切割,所以成兩個片段。實驗顯示海洛因白質腦病患者46%存在著相關基因的突變。因此推斷線粒體功能的缺陷部分是因13513GA突變引起,但是有可能存在其它的基因突變位點�；蚪M全序列研究發(fā)現(xiàn),通過對6例海洛因白質腦病患者腦組織及外周血中線粒體的基因組全序列分析,發(fā)現(xiàn)了3個具有共性的突變位點,如：A5178C、 A4659G和A106777G等,A5178C、A4659G位于NADH2編碼的序列中,A106777G位于NADH4編碼的序列中,編碼的序列均涉及NADH一泛醌還原酶,而該還原酶則是線粒體有氧代謝的最重要的能量環(huán)節(jié)之一,容易受到環(huán)境中各種毒物的影響而造成線粒體能量代謝障礙。這是線粒體相關疾病的突變熱區(qū),如：線粒體復合酶缺乏癥、帕金森病等,推測上訴區(qū)域在一定的毒性環(huán)境下可造成能量代謝的障礙,從而致使大腦白質的損害,在遺傳背景上解釋了在一定的人群中有易感性,因此推測,線粒體呼吸鏈受損并繼發(fā)腦組織有氧能量代謝障礙可能是HSLE發(fā)病中的重要環(huán)節(jié)。 根據以上證據,推測本病可能的發(fā)病機制是：海洛因白質腦病是一種與中毒代謝性疾病相關,具有一定的遺傳易感性,損害的原因是該毒物損害了少突膠質細胞線粒體的能量代謝,造成繼發(fā)性大腦白質區(qū)的髓鞘脫失。通過對線粒體膜電位及呼吸鏈復合體I (NADH-輔酶Q還原酶)、呼吸鏈復合體Ⅱ(琥珀酸-輔酶Q還原酶)、呼吸鏈復合體Ⅲ(輔酶Q-細胞色素C還原酶)、呼吸鏈復合體Ⅳ(細胞色素C還原酶)測定,以了解該病是否與線粒體功能障礙有關,以研究中毒性白質腦病發(fā)病機制。 主要研究內容包括：1、用HE、電鏡等研究手段對臨床各期HSLE患者的病理學特征(白質損害)進行比較研究,特別是明確髓鞘、軸突以及少突膠質細胞三者之間的損害程度的比較分析,進一步闡明其因果關系；對海洛因腦病頭顱CT及磁共振檢查進行總結,與其他中毒性腦病相對比以了解有無共同之處；2、檢測HSLE患者外周血中的線粒體功能,流式細胞儀技術檢測線粒體的通透性改變,探討線粒體功能狀態(tài)在HSLE發(fā)病中的作用；3、初步闡明HSLE的發(fā)病機制,為臨床治療提供指導意見和理論依據。 目的 本研究通過上述各種臨床,用實驗證據驗證線粒體能量代謝紊亂在HSLE發(fā)病中是否具有重要作用。檢測HSLE患者外周血中的線粒體膜電位及呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,探討線粒體功能狀態(tài)在發(fā)病中的作用,有助于進一步加深我們對該病的了解及中毒性白質腦病損害機制認識。運用HE染色、少突膠質細胞染色及常規(guī)透射電鏡觀察,進一步明確HSLE最具本質的特征性病理學表現(xiàn),并對海洛因腦病頭顱CT及磁共振檢查進行總結,深入比較HSLE白質損害與其他腦白質病變的差異；如條件允許,可對該病患者的外周血進行線粒體基因組全序列分析,以進一步對HSLE患者進行遺傳學分析。 方法 納入2000年3月至2012年8月門診或曾在南方醫(yī)院神經內科住院的海洛因海綿狀白質腦病患者(HSLE組)及在我院體檢的健康體檢者(對照組,無成癮性藥物使用史)各36例。分別檢測兩組人員肘靜脈血的線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ(NADH-輔酶Q還原酶)、Ⅱ(琥珀酸-輔酶Q還原酶)、Ⅲ(輔酶Q-細胞色素C還原酶)、呼吸鏈復合體Ⅳ(細胞色素C還原酶)、線粒體膜電位及病理學技術。線粒體膜電位測定采用流式細胞儀技術,對比左上象限和右下象限熒光的強度來反映樣本中淋巴細胞線粒體的膜電位狀況；線粒體呼吸鏈復合體損傷測定采用酶聯(lián)免疫分析方法,與正常對照組相比較來分析海洛因白質腦病患者線粒體功能情況；運用病理學技術如HE染色、少突膠質細胞染色等,常規(guī)透射電鏡觀察髓鞘和少突膠質細胞超微結構；對該疾病進行影像學方面的研究及總結,如頭顱CT、磁共振檢查。 1、線粒體膜電位測定： 測定方法：先溶血然后分離純化得到白細胞,再用熒光探針JC-1對白細胞線粒體進行標記及流式細胞儀檢測,線粒體膜電位經流式細胞儀檢測后出現(xiàn)JC-1熒光強度的變化流式圖,JC-1在線粒體內成聚合物以紅色熒光為主。膜電位去極化異常的線粒體內成單體以綠色熒光為主。然后將得到的白細胞流式圖設置卡門,將白細胞中的淋巴細胞提取出來,再用密度圖來分析：將圖像十字線劃為四分,左上象限代表紅色熒光線粒體,而右下象限代表綠色熒光線粒體,對比左上象限和右下象限熒光的強度能反映樣本中淋巴細胞線粒體的膜電位狀況。 2、線粒體呼吸鏈復合體損傷測定： 測定方法：采用酶聯(lián)免疫分析方法,應用雙抗體夾心,加底物TMB顯色,用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)。通過上述方法分別測定36例HSLE與正常對照者外周血白細胞線粒體呼吸鏈復合物活性的吸光度,并比對標準曲線,計算樣品中人線粒體呼吸鏈復合體I (NADH-輔酶Q還原酶)、Ⅱ(琥珀酸-輔酶Q還原酶)、Ⅲ(輔酶Q-細胞色素C還綿狀白質腦病原酶)、呼吸鏈復合體Ⅳ(細胞色素C還原酶)濃度,并與正常對照組相比較,以分析海洛因腦病患者線粒體功能。 3、病理學及影像學技術： 測定方法：病理組織標本行常規(guī)5um厚度石蠟切片,分別進行HE染色、甲苯胺藍尼氏體染色、Cajal神經細胞染色、髓鞘染色(Loyes染色、Luxol fast blue染色、固綠髓鞘染色)、變性髓鞘染色(鋨酸—a萘酸染色以及常規(guī)Marchi染色)、少突膠質細胞染色(Weil-Davenport染色)。常規(guī)透射電鏡觀察,主要觀察髓鞘和少突膠質細胞超微結構。 影像學上CT成像運用CT機以OM線為基準間隔10mm連續(xù)掃描。MRI成像運用MRI儀,以標準頭部成像體位進行冠狀、矢狀及軸狀三平面掃描,掃描序列為T1WI、T2WI快速自旋回波序列(TSE),長T1快速反轉恢復序列(FLAIR)。 結果 1、影像學及病理學結果： 頭顱CT示：雙側小腦、基底節(jié)及皮層下白質廣泛低密度,小腦中線兩側白質呈對稱性邊界清楚的蝴蝶樣低密度病灶。頭顱MRI示：雙側小腦、內囊、枕頂葉深部等處白質廣泛、基本對稱異常信號,嚴重病例腦干有對稱性異常信號。病理表現(xiàn)：HE染色光鏡下觀察到從灰白質交界處向白質空泡逐漸增多,白質區(qū)大量大小不均空泡形成,中樞神經系統(tǒng)白質呈海綿狀改變。電鏡下觀察到少突膠質細胞大量空泡退行性變,線粒體腫脹,內質網擴張,髓鞘有空泡,很多部位髓鞘被渦輪狀空泡裂解。 2. HSLE組與對照組線粒體膜電位比較： 與對照組比較,兩組年齡、性別水平比較,無明顯差異,差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與對照組比較,HSLE組左上象限和右下象限熒光的強度之比較正常組較大,(0.18±0.05)VS(0.24±0.07),t=3.893, P0.001,差異具有統(tǒng)計學意義,而左上象限代表紅色熒光線粒體,右下象限代表綠色熒光線粒體,紅色熒光線粒體代表線粒體膜電位較高,綠色熒光線粒體代表線粒體膜低時,由此結果表示HSLE組線粒體膜電位活性較正常組明顯下降,存在線粒體功能障礙,這可能是海洛因腦病患者發(fā)病的原因。 3、HSLE組與對照組線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ比較 HSLE組患者VS對照組：HSLE組線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ活性結果VS對照組分別為5.6±2.4U/ml VS4.2±2.1U/ml. 統(tǒng)計學結果表明,與對照組比較,HSLE組線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ活性活性降低(t=2.634,P0.05),存在線粒體功能缺陷,線粒體功能障礙在海洛因腦病發(fā)病過程中可能起到重要作用。 4、HSLE組與對照組線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ比較： HSLE組患者VS對照組：正常對照組和病患組線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ活性不符合正態(tài)分布,經Wilcoxon W檢驗統(tǒng)計量為957.5,Mann-Whitney U統(tǒng)計量為291.5,Z=-4.015.P0.001。 統(tǒng)計學結果表明,與對照組比較,HSLE組線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ活性活性降低存在線粒體功能缺陷,線粒體功能障礙在海洛因腦病發(fā)病過程中可能起到重要作用。 5, HSLE組與對照組線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ比較： HSLE組患者VS對照組：HSLE組線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ活性結果VS對照組分別為分別為值17.42±4.02U/ml和21.75±5.15U/ml。 統(tǒng)計學結果表明,與對照組比較,HSLE組線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ活性活性降低(t=3.978,P0.001),存在線粒體功能缺陷,線粒體功能障礙在海洛因腦病發(fā)病過程中可能起到重要作用。 6. HSLE組與對照組線粒體呼吸鏈復合物Ⅳ比較： HSLE組患者VS對照組：HSLE組線粒體呼吸鏈復合物Ⅳ活性結果VS對照組分別為133.65±17.80和145.79±15.57U/ml。 統(tǒng)計學結果表明,與對照組比較,HSLE組線粒體呼吸鏈復合物Ⅳ活性活性降低(t=3.079,P0.003),存在線粒體功能缺陷,線粒體功能障礙在海洛因腦病發(fā)病過程中可能起到重要作用。 結論 1、根據本病頭顱CT、磁共振及病理組織活檢發(fā)現(xiàn),發(fā)生癥狀的海洛因白質腦病的吸毒者病灶比較容易發(fā)生在小腦白質區(qū),典型特征為中線兩側白質呈邊界清楚的對稱的蝴蝶樣的低密度病灶。白質區(qū)內有大量大小不均空泡形成,線粒體腫脹,內質網擴張,呈海綿狀改變。推測本病可能是中毒性腦病的其中一種,發(fā)病機制目前推測與線粒體這個細胞器代謝功能有關,需進一步實驗驗證。 2、對本病的線粒體膜電位檢測發(fā)現(xiàn),海洛因海綿狀白質腦病組線粒體膜電位活性較正常組明顯下降,它是線粒體調亡的信號,推測本病可能的發(fā)病機制為：燙吸過程中產生的毒物使海洛因海綿狀白質腦病患者機體內細胞的線粒體功能發(fā)生了障礙,致使細胞內能量合成不足,導致乳酸的堆積,對缺氧敏感的顱內組織出現(xiàn)廣泛的白質繼發(fā)脫髓鞘,導致了神經系統(tǒng)癥狀及體征的出現(xiàn)。目前雖本研究已證實本病線粒體膜電位活性下降,是否存在線粒體內相關酶系統(tǒng)活性受損,需要行下面呼吸鏈復合體損傷實驗進一步驗證。 3、通過對正常人與海洛因海綿狀白質患者外周血白細胞線粒體呼吸鏈復合物酶復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性：它們分別是NADH-輔酶Q還原酶,琥珀酸-輔酶Q還原酶,泛醌—細胞色素C還原酶,細胞色素C氧化酶的檢測,研究結果顯示兩組之間線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性有顯著差異,海洛因海綿狀白質腦病患者線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均低于正常對照組,進一步證實線粒體功能障礙在海洛因海綿狀白質腦病的發(fā)病中起著重要作用。進一步說明了髓鞘脫失不是由毒物直接損害髓鞘所致,而是少突膠質細胞繼發(fā)缺氧受損的結果。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742

【參考文獻】

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本文編號：2017066