本文選題：水通道蛋白4 + 視神經脊髓炎��； 參考：《河北醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：目的：視神經脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO），又名Devic綜合征，是中樞神經系統(tǒng)（central nervous system，，CNS）一種嚴重的特發(fā)性炎癥性脫髓鞘性疾病，主要表現為單相或復發(fā)病程的視神經炎和橫貫性脊髓炎。典型特征為病情反復發(fā)作，預后較差。NMO的發(fā)病機制尚不明確。在北美，非白種人口中NMO患者比例比經典MS（multiple sclerosis，MS）患者的高。在亞洲，視神經脊髓型MS是一種常見的炎性脫髓鞘疾病，在日本它大約占MS的5-40％。亞洲的視神經脊髓型MS和西方的NMO是同一疾病實體嗎？很多呈現NMO初期癥狀的患者被誤診為MS，但這兩種疾病的預后和最佳治療方案不同。NMO的臨床表現較MS嚴重且預后差。第一次發(fā)病后的5年內，約50％的患者需要協(xié)助行走，約62％的患者至少一只眼睛失去功能性視力甚至失明，約15-30％的患者死于高頸段脊髓炎誘發(fā)的呼吸衰竭和腦干參與的致命性自主神經失調。免疫抑制藥物被認為是NMO的最佳治療，而免疫調節(jié)藥物是目前推薦的用于早期MS的有效治療。直到NMO-IgG被發(fā)現，其靶抗原為CNS中的水通道蛋白4（AQP4）。AQP4自身抗體的檢測在NMO和MS的鑒別診斷中可能發(fā)揮重要作用，Wingerchuk新修訂的NMO診斷標準更把其作為支持診斷的一個重要指標，但AQP4自身抗體檢測的低敏感性和特異性仍是待解決的重要問題。 本研究試圖構建人AQP4的重組質粒，并檢測其融合蛋白在人胚腎細胞系（HEK293）中的表達，為日后檢測NMO患者血清中的AQP4抗體提供一種高敏感性和特異性的實驗方法，初步將NMO和MS鑒別開來，使臨床治療更具有針對性和個體化，并可進一步深入挖掘NMO的可能發(fā)病機制，為疾病活動、復發(fā)和轉歸的預測提供有意義的基礎實驗依據。 方法： 1人AQP4基因的獲取 1.1引物設計合成：參照Genebank公布的人AQP4基因序列，分別設計其上下游引物，上游引物含NheⅠ酶切位點，下游引物含XhoⅠ酶切位點。以內參β-肌動蛋白（β-actin）作為陽性對照。 1.2腦組織中總RNA的提取：腦組織取自河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經外科手術患者，采用Trizol法提取其總RNA，提取產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并測定其純度和濃度。 1.3RT-PCR擴增AQP4基因：利用隨機引物將總RNA反轉錄為cDNA，再以cDNA為模版，利用AQP4特異性上下游引物將cDNA擴增為DNA，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定和純化。 2重組質粒的構建 AQP4亞型a和空質粒pEGFP-N1分別以限制性內切酶NheⅠ和XhoⅠ雙酶切過夜，鑒定酶切產物并回收純化。將酶切純化的AQP4和pEGFP-N1用T4連接酶連接，將連接產物轉化到感受態(tài)細胞--大腸桿菌DH5α，在硫酸卡那霉素抗性LB平板培養(yǎng)過夜，同時以轉化pEGFP-N1作為對照。挑取單克隆后擴大培養(yǎng)，然后用質粒提取試劑盒抽提重組質粒。 3重組質粒的鑒定 3.1酶切鑒定：將獲得的重組質粒和空質粒分別進行單酶切和雙酶切，所得產物進行瓊脂糖凝膠電泳以檢測重組質粒經雙酶切后是否可切出完整AQP4基因。 3.2測序鑒定：將獲得的重組質粒送上海生工測序，測序結果與GenBank中人AQP4序列進行比對。 4細胞轉染、鑒定及篩選穩(wěn)定表達細胞株 4.1HEK293細胞的轉染：轉染前一天，將合適數量的細胞接種至24孔板，常規(guī)培養(yǎng)至70%～80%細胞融合，通過Lipofectamine2000介導將重組質粒轉染到HEK293細胞，同時轉染pEGFP-N1為對照。 4.2檢測綠色熒光蛋白（GFP）的表達：轉染48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察重組質粒組、空質粒組和未轉染處理組的GFP表達情況。 4.3轉染細胞的篩選：轉染細胞培養(yǎng)24h后觀察瞬時轉染效率，同時將800mg/L的G418加入培養(yǎng)液，兩周后篩選出穩(wěn)定表達株，觀察穩(wěn)定轉染率。聯合應用流式細胞儀分選提高穩(wěn)定轉染率。 5鑒定AQP4在HEK293細胞中的表達 分別采用RT-PCR、Western Blot、間接免疫熒光法鑒定AQP4在HEK293細胞中的基因和蛋白水平的表達情況，進一步將固定的細胞置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，確定穩(wěn)定表達細胞株融合蛋白是否具有膜定位效應。 結果： 1RT-PCR擴增人AQP4基因：RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖可見清晰的特異性擴增條帶，與理論預期值相符。 2重組質粒的鑒定：重組質粒的雙酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳后在理論預期值處可見一特異性條帶，單酶切產物未見條帶；測序結果與理論序列符合率大于99%。 3轉染細胞的鑒定及篩選：重組質粒組可見GFP表達且熒光主要位于細胞膜上，空質粒組可見GFP表達且熒光主要位于包漿中，未轉染處理組未見GFP表達；G418抗生素聯合流式細胞儀篩選使穩(wěn)定轉染效率達90%以上。 4鑒定AQP4在HEK293細胞中的表達： RT-PCR檢測AQP4的表達：RT-PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，在972bp處可見一條特異性條帶； Western Blot檢測AQP4的表達：在轉染重組質粒的細胞中提取的蛋白經WB檢測分析，在61KD的位置出現特異性條帶，而轉染空質粒的細胞未見特異性條帶；間接免疫熒光法檢測AQP4的表達：熒光顯微鏡下觀察進行抗原抗體反應后的轉染重組質粒細胞，藍光激發(fā)時細胞表面呈綠色熒光，綠光激發(fā)時細胞表面呈現為紅色熒光，兩者于細胞膜位置重合良好；AQP4-GFP融合蛋白的細胞定位：激光共聚焦顯微鏡下觀察，轉染重組質粒的細胞內綠色熒光充滿整個細胞,無明顯局部定位；轉染重組質粒的細胞綠色熒光明顯定位于細胞膜區(qū)域。 結論： 成功克隆并構建了pEGFP-N1-AQP4重組質粒，并在HEK293細胞中穩(wěn)定表達，為日后檢測NMO患者血清中的AQP4抗體提供了一種高敏感性和特異性的實驗方法，并可進一步深入挖掘NMO的可能發(fā)病機制，為NMO疾病活動、復發(fā)和轉歸的預測提供有意義的基礎實驗依據。
[Abstract]:Objective : Neuromyenteric optica ( NMO ) , also known as Devic ' s syndrome , is a severe idiopathic inflammatory demyelinating disease in central nervous system ( CNS ) . It is characterized by recurrent onset of disease and poor prognosis . In Asia , the target antigen is the best treatment for early MS . In Asia , it is considered that the target antigen is the water channel protein 4 ( AQP4 ) in the CNS . The detection of AQP4 autoantibody may play an important role in differential diagnosis of NMO and MS . The low sensitivity and specificity of AQP4 autoantibody detection are still important issues to be resolved .

This study attempts to construct recombinant plasmid of human AQP4 , and to detect the expression of fusion protein in human embryonic kidney cell line ( HEK ) . To provide a high sensitivity and specificity for AQP4 antibody in serum of NMO patients , it is suggested that NMO and MS can be identified separately , which makes clinical treatment more targeted and individualized , and can further explore the possible pathogenesis of NMO . It provides a meaningful basis for predicting disease activity , recurrence and prognosis .

Method :

1 Human AQP4 gene acquisition

1.1 primer design and synthesis : referring to the human AQP4 gene sequence published by Genebank , respectively designing the upstream and downstream primers , the upstream primer containing the Nhe I cleavage site , the downstream primer containing the Xho I cleavage site , and using the internal reference beta - actin ( . beta . - actin ) as a positive control .

1.2 Extraction of total RNA from brain tissue : The brain tissue was taken from the second hospital neurosurgery patient of Hebei Medical University . The total RNA was extracted by Trizol method . The extracted product was identified by agarose gel electrophoresis and its purity and concentration were determined .

1 . The AQP4 gene was amplified by RT - PCR : the total RNA was reversely transcribed into cDNA by using random primers , the cDNA was used as a template , the cDNA was amplified into DNA by using an AQP4 specific upper and downstream primer , and the amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis analysis and identification and purification .

Construction of Recombinant Plasmid

The recombinant plasmid was purified by restriction endonuclease Nhe 鈪

本文編號：2013994