發(fā)布時間：2018-06-08 22:49

  本文選題：全腦缺血 + 抑制劑　； 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景腦的能量代謝具獨有的特點,腦是氧耗量最高的組織,同時也是葡萄糖代謝最旺盛的組織,但糖是腦的主要供能物質,腦賴以產生能量的底物少,儲存的能量極少,所以腦細胞能量代謝障礙是缺血性腦損傷首先發(fā)生的非常重要的環(huán)節(jié)。在腦缺血缺氧時,細胞內氧化代謝障礙,只能依靠葡萄糖無氧酵解產生能量,糖降解作用增加數倍,從而產生由丙酮酸還原而來的乳酸,乳酸在腦細胞內堆積造成腦細胞內的酸中毒,導致腦水腫,同時腦細胞的ATP和磷酸肌酸很快減少、耗竭殆盡,使得腦細胞能量來源不足,致使細胞膜離子泵功能受損,腦細胞腫脹,造成神經元損傷、凋亡和死亡。因此,臨床上發(fā)生心臟驟停、嚴重休克等可通過影響全腦或局部腦血液循環(huán),使得腦血流的突然減少或停止,大大降低了腦組織氧和糖的供應,引起腦細胞的能量衰竭,可導致神經元嚴重的缺血、損傷,甚至造成不可逆的腦損傷,尤其是更易損害對缺血敏感的海馬,臨床表現(xiàn)為神經功能損害、認知功能障礙,如記憶和感覺運動障礙。在美國,每年約有326000門診患者和209000住院患者發(fā)生心臟驟停(cardiac arrest,CA),心臟驟停和復蘇會導致短暫性全腦缺血性損傷和缺血再灌注損傷,這種損傷是CA后高致殘率、高死亡率的主要因素。然而,盡管全球權威的專業(yè)組織定期更新心肺復蘇指南,并培訓、指導目擊者在第一時間內參與復蘇,但效果仍然不佳,且發(fā)生的腦損傷目前仍缺乏有效的治療措施,所以發(fā)生CA的患者其預后依然很差,據報道,心臟驟�；颊咧械男掖嬲吣芑謴土己玫纳窠浌δ艿牟坏�9%。這嚴重影響早期復蘇成功患者生活質量的同時也給社會帶來沉重的經濟負擔,從而嚴重危害人類健康。隨著社會、科技進步和醫(yī)學研究的發(fā)展,出現(xiàn)了許多治療神經系統(tǒng)疾病的新藥和新方法,雖然也有一些針對急性腦缺血或再灌注后細胞損傷的神經保護劑,但其療效與安全性仍不確定。全腦缺血性腦損傷和缺血再灌注性腦損傷的發(fā)病機制機制仍不清楚,可能的機制有能量代謝障礙、興奮性氨基酸的神經毒性、細胞內鈣超載、氧自由基損傷、一氧化氮(nitric oxide,NO)損傷以及炎癥反應、凋亡等,以上各種機制往往互為因果、共同作用,形成損傷級聯(lián)反應,最終導致神經細胞損傷。其中神經元凋亡是神經元死亡的一種形式,特別是在遲發(fā)性神經元死亡中起著非常重要的作用,在缺血性腦損傷早期就出現(xiàn)凋亡細胞并持續(xù)幾天或幾周,且凋亡級聯(lián)反應的激活可能是通向細胞死亡的最后共同通路,它可引起細胞繼發(fā)性壞死。另有研究表明,炎癥是機體對損傷最重要的宿主反應,神經炎癥在全腦缺血性損傷及中樞神經系統(tǒng)的許多疾病中起著關鍵的作用,大量臨床和基礎研究均已發(fā)現(xiàn),在腦缺血過程中存在炎性反應,包括小膠質細胞和星形膠質細胞的活化、炎性因子和趨化因子的產生、白細胞和單核細胞浸潤,以及黏附分子、補體和金屬蛋白酶類表達水平和活性的升高。其中促炎性細胞因子白細胞介素(Interleukin,IL)1 β(IL-1β)和白細胞介素18(IL-18),被認為是特別重要的炎癥介質,而工L-1β和IL-18是需要將它們的無活性前體蛋白水解成活性分子后才能發(fā)揮作用,這個活化過程的關鍵酶是IL-1β轉化酶,也稱為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-1),因此,caspase-1也被認為是炎癥的同義詞,然而,除了促進神經炎癥外,caspase-1也是一種促凋亡的蛋白酶,有文獻報道,caspase-1可直接參與非感染性的細胞死亡過程。既然caspase-1與炎癥、凋亡等密切相關,那么caspase-1是否確實通過以上方式及其他方式參與缺血性腦損傷過程,并影響其結果哪?有研究發(fā)現(xiàn),在基因敲除或抑制caspase-1的小鼠,能減輕腦缺血引起的腦損傷,改善缺血后神經功能。因此,caspase-1抑制劑可能在缺血性腦損傷中發(fā)揮著一定的神經保護作用。如能證明caspase-1抑制劑治療缺血性腦損傷的有效性并探索可能機制,有助于為缺血性腦損傷的治療提供新的線索和潛在的藥物靶點,有著重要的醫(yī)學價值和社會意義。Caspase是一個半胱氨酸蛋白酶家族,可以在特定的天冬氨酸殘基位點裂解靶蛋白,已經證實幾乎caspase家族的每個成員均以不同的形式和機制參與缺血性腦損傷,而caspase-1是caspase家族中非常重要的一員,它是與神經炎癥密切相關的酶,是影響許多中樞神經系統(tǒng)相關疾病的關鍵因素。有趣的是,caspase-1不僅被認為是炎癥過程的重要調節(jié)因子,而且是細胞凋亡關鍵的執(zhí)行者。然而,目前尚不明確,caspase-1抑制劑是否能夠調節(jié)短暫性全腦缺血導致的細胞凋亡和隨之發(fā)生的死亡,本研究也關注的是,caspase-1抑制劑經鼻給藥是否對短暫性全腦缺血導致的損傷具有保護作用。研究目的1.利用大鼠四動脈阻斷全腦缺血模型,探索在全腦缺血再灌注后經鼻給予天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1抑制劑Ⅳ(caspase-1 Inhibitor Ⅳ,Boc-D-CMK;caspase-1抑制劑的一種)是否能減輕全腦缺血再灌注誘導的炎癥。2.利用大鼠四動脈阻斷全腦缺血模型,探索在全腦缺血再灌注后經鼻給予Boc-D-CMK是否能減輕全腦缺血再灌注誘導的凋亡及神經元損傷。3.利用大鼠四動脈阻斷全腦缺血模型,探索在全腦缺血再灌注后經鼻給予Boc-D-CMK是否對全腦缺血再灌注誘導的功能損害有保護作用。4.利用大鼠四動脈阻斷全腦缺血模型,探討caspase-1參與保護全腦缺血再灌注誘導的神經元損傷的可能機制。研究方法1.清潔級健康SD大鼠6只,雄性,應用生物素標記的caspase-1抑制劑經鼻給藥12小時后處死大鼠,利用共聚焦顯微鏡顯像觀察生物素標記的caspase-1抑制劑在腦內的分布情況。2.清潔級健康SD大鼠12只,雄性,在大鼠四動脈結扎全腦缺血模型中,采用分光光度比色法檢測缺血再灌注后不同時間點caspase-1的活性。3.清潔級健康SD大鼠48只,雄性,隨機分為三組：假手術對照組；缺血組；缺血+Boc-D-CMK組(治療組)。采用大鼠四動脈結扎全腦缺血模型,應用免疫印跡、免疫組化研究蛋白表達量的變化,采用分光光度計比色法檢測酶的活性,采用ELISA的方法檢測炎癥因子的分泌,利用免疫熒光和激光共聚焦技術觀察蛋白的表達、神經元凋亡、神經元存活和線粒體的膜電勢,采用焦油紫染色和TUNEL染色研究海馬CAI區(qū)神經元細胞存活和凋亡,應用巴恩斯迷宮和新物體識別實驗判斷大鼠的學習記憶、記憶缺失等神經功能損害。研究結果1、成年雄性SD大鼠海馬CAI區(qū)caspase-1蛋白的表達首先,我們觀察了在不進行缺血的假手術大鼠海馬CAI區(qū)caspase-1蛋白的基礎表達。采用免疫熒光染色法檢測caspase-1、微管相關蛋白(Microtubule associated protein-2,MAP2)和膠質纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)顯示了caspase-1在大鼠海馬CAI區(qū)的表達,且結果發(fā)現(xiàn)caspase-1在海馬CAI區(qū)與MAP2和GFAP共染,提示caspase-1在在大鼠腦內神經元和星形膠質細胞中表達。進一步研究發(fā)現(xiàn),在全腦缺血再灌注后第三天和第十四天,caspase-1在海馬CAI區(qū)星形膠質細胞存在明顯的過表達。2、生物素標記的caspase-1抑制劑經鼻給藥后在中樞神經的分布應用生物素標記的caspase-1抑制劑經鼻給藥12小時后處死大鼠,取腦片常規(guī)處理后加入二抗,利用共聚焦顯微鏡顯像觀察了生物素標記的caspase-1抑制劑在腦內的分布,結果提示caspase-1抑制劑經鼻給藥后可以滲入大鼠腦內,且證實藥物可以分布在缺血敏感的海馬CAI區(qū),caspase-1抑制劑主要分布在海馬和皮層神經元的細胞漿內。3、經鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理可以抑制全腦缺血誘導的海馬CAI區(qū)caspase-1的過表達和caspase-1的活性首先該研究測定了大鼠全腦缺血再灌注后海馬CAI區(qū)caspase-1活性的時間曲線。研究結果發(fā)現(xiàn),與缺血前相比,在大鼠全腦缺血再灌注后所有時間點caspase-1活性均增加,大鼠全腦缺血再灌注后第3天前后達到高峰,第5天仍維持在較高水平。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)經鼻給予Boc-D-CMK可明顯抑制大鼠全腦缺血再灌注后第3天海馬CAI區(qū)活化的caspase-1,且這種活化的caspase-1多在星形膠質細胞內表達。4、經鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理可以改善全腦缺血誘導的海馬CAI區(qū)神經元線粒體功能經鼻給予Boc-D-CMK后處理能逆轉全腦缺血誘導的海馬CAI區(qū)神經元線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential,MMP)變化,能明顯增加線粒體細胞色素C氧化酶活性,免疫印跡法結果分析進一步表明,Boc-D-CMK能減少全腦缺血誘導的海馬CA1區(qū)神經元內細胞色素C從線粒體向細胞漿的釋放,從而增加細胞色素C在線粒體的含量,可能減輕全腦缺血對神經元線粒體功能的損害。5、經鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理可以抑制全腦缺血再灌注誘導的海馬CA1區(qū)活化的caspase-9和活化的caspase-3的激活共聚焦結果顯示,在大鼠全腦缺血再灌注第3天,活化的caspase-9和活化的caspase-3的活性顯著增加。通過雙重免疫熒光染色研究表明,活化的caspase-9和活化的caspase-3與神經元特異性核蛋白(Peuronal-specific nuclear protein,NeuN)陽性細胞共染,而經鼻給予Boc-D-CMK后處理能明顯減少共染的活化的caspase-9及活化的caspase-3的激活。6、經鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理可以抑制全腦缺血再灌注誘導的海馬CA1區(qū)的凋亡免疫熒光染色顯示,在全腦缺血再灌注后第3天,全腦缺血再灌注誘導海馬CA1區(qū)細胞層TUNEL陽性細胞數和聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶(Poly ADP-ribose polymerase, PARP1)陽性細胞數明顯增加,而經鼻給予Boc-D-CMK后處理能顯著減少TUNEL陽性細胞數和PARP1陽性細胞數的增加。7、經鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理能減少全腦缺血誘導的海馬CA1區(qū)小膠質細胞的激活和星形膠質細胞的活化首先,Western blotting檢測結果顯示,在全腦缺血再灌注后第3天,海馬CA1區(qū)離子鈣接頭蛋白抗體(Ionized calcium-binding adaptor molecule-1,Iba1)和GFAP含量與假手術對照組相比明顯增加,表明在全腦缺血再灌注早期階段即誘導膠質細胞增生,而經鼻給予Boc-D-CMK后處理可明顯降低Ibal和GFAP的增加。共聚焦顯微鏡結果提示,在全腦缺血再灌注后第14天,缺血再灌注誘導小膠質細胞和星形膠質細胞激活,經鼻給予Boc-D-CMK后處理可抑制小膠質細胞和星形膠質細胞激活或活化。8、經鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理可抑制海馬CA1區(qū)全腦缺血再灌注誘導的炎性細胞因子的產生和減少神經元死亡在全腦缺血再灌注后第3天,海馬CA1區(qū)炎性細胞因子IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-a分泌顯著增加,經鼻給予Boc-D-CMK后處理明顯抑制了海馬CA1區(qū)炎性細胞因子的產生。通過焦油紫染色、NeuN染色共聚焦顯微鏡顯像進行的組織學評價,證實全腦缺血再灌注可誘導缺血易損的海馬CA1區(qū)局部神經元死亡,經鼻給予Boc-D-CMK后處理顯著增加全腦缺血再灌注后第14天海馬CA1區(qū)神經元存活數量。9、經鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理能改善大鼠全腦缺血再灌注誘導的空間學習記憶能力障礙,能顯著增強缺血后大鼠的新物體識別的長程記憶能力。應用巴恩斯迷宮評估大鼠海馬依賴的空間學習和記憶能力發(fā)現(xiàn),全腦缺血再灌注后大鼠定位到目標逃離暗箱的時間明顯延長,并且在探索階段測試中,在目標逃離暗箱所在四分之一象限停留的時間縮短,而經鼻給予Boc-D-CMK后處理能改善大鼠空間學習與記憶能力。由于海馬的完整性還與如新物體識別記憶能力的非空間的學習記憶能力有關,本研究應用新物體識別試驗評估各組大鼠,發(fā)現(xiàn)全腦缺血再灌注后的大鼠對新物體的識別指數降低,經鼻給予Boc-D-CMK后處理能改善大鼠新物體識別能力的下降。研究結論1.經鼻給予的Boc-D-CMK能進入中樞神經系統(tǒng),隨后發(fā)揮抑制caspase-1的活性,降低神經元線粒體的功能損害,抑制缺血易損的海馬CA1區(qū)活化的caspase-3、活化的caspase-9和凋亡,能增加神經元的存活數量。2.經鼻給予的Boc-D-CMK改善大鼠全腦缺血導致的學習記憶障礙、長程識別能力下降。3.進一步的研究表明,經鼻給予Boc-D-CMK發(fā)揮神經保護作用的可能機制如下：抑制過度膠質活化、抑制下游促炎因子減輕神經炎癥的反應、顯著增加海馬CA1區(qū)NeuN-陽性細胞數而減少TUNEL-陽性細胞數和PARP1-陽性細胞數�？傊�,本研究表明,經鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK能通過調節(jié)抗炎和抗凋亡的作用以減少大鼠全腦缺血后海馬CA1區(qū)的神經細胞死亡,使其功能損害得以改善。該研究提示,抑制caspase-1可能是治療短暫全腦缺血后神經損傷和功能障礙的很有前途、前景的治療策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R741

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本文編號：1997530