本文選題：GOLPH3 + NDRG1�。� 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：膠質(zhì)瘤(Glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤,約占顱內(nèi)腫瘤的44.69%,居顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率的第一位。不可否認(rèn),對(duì)于膠質(zhì)瘤發(fā)病因素及發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)有助于膠質(zhì)瘤的有效預(yù)防以及尋找最新的靶向治療措施。目前,膠質(zhì)瘤的治療效果依然很差,一般患者的5年生存率只有5%左右,國(guó)際上仍無(wú)良好的治療辦法,導(dǎo)致膠質(zhì)瘤預(yù)后不佳的根本原因在于它一系列的惡性生物學(xué)行為,包括腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖、對(duì)周圍腦組織的侵襲、化療藥物耐藥等,尤其是腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖,是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤術(shù)后快速?gòu)?fù)發(fā)的重要因素。目前的治療理念是先以顯微鏡下最大限度的腫瘤手術(shù)切除為主,然后聯(lián)合放射治療及化療作為輔助治療的綜合治療,但是由于膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)部位的特殊性以及其無(wú)節(jié)制生長(zhǎng)的臨床特點(diǎn),治療效果并不理想,腫瘤細(xì)胞的這種快速增殖和早期向周圍正常腦組織浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移,使其成為預(yù)后最差的腫瘤。自二十世紀(jì)以來(lái),隨著分子醫(yī)學(xué)研究和腫瘤基因?qū)W的發(fā)展不斷的深入,人們對(duì)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制亦取得了一些新的認(rèn)識(shí),但是仍未找到一個(gè)行之有效、具體的防治辦法和治療措施。尋找一種新的、有效的、具有較高特異度的分子基因標(biāo)志物,能夠?qū)δX膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行早期的預(yù)后判斷就變得尤為重要。如何有效的抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖,從而延長(zhǎng)患者的生存期并改善其生存質(zhì)量,也是目前膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域的一大難題。因此,對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞過(guò)度增殖的分子作用機(jī)制進(jìn)行研究,并針對(duì)其進(jìn)行有效的干擾和抑制,探討膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)已成為膠質(zhì)瘤基因治療攻關(guān)的重點(diǎn)。近年來(lái),為了探索膠質(zhì)瘤的發(fā)病原因及其易感性,膠質(zhì)瘤相關(guān)基因方面的研究逐漸展開(kāi),目前成為熱點(diǎn)。其特定的基因組及組織學(xué)特點(diǎn)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤成為復(fù)雜多因素疾病。多個(gè)研究表明,癌基因、抑癌基因和相關(guān)的調(diào)控基因均參與其中。高爾基體磷蛋白3(GOLPH3:Golgi phosphoprotein 3)被認(rèn)為是外殼蛋白(coat proteins)的一種,不同于其他的細(xì)胞膜癌基因蛋白,GOLPH3大部分位于Trans-Golgi Network (TGN),由于這個(gè)原因,它被定義為第一個(gè)高爾基體的癌基因。由5p13染色體(在一些實(shí)體腫瘤中經(jīng)常擴(kuò)增的染色體區(qū)域)上的基因進(jìn)行編碼,通過(guò)結(jié)合基因組學(xué)、臨床病理及功能分析,人類GOLPH3被確認(rèn)為是一種新的癌蛋白。2009年ScottKL等報(bào)道,GOLPH3可能是癌癥發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵因素,在多種實(shí)體惡性腫瘤中存在過(guò)量表達(dá),并參與囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞分裂及蛋白質(zhì)糖基化等多個(gè)腫瘤形成過(guò)程,表明GOLPH3可作為一種癌蛋白發(fā)揮作用,并推測(cè)GOLPH3在腫瘤中的作用與nTOR信號(hào)通路有關(guān),腫瘤細(xì)胞對(duì)雷帕霉素敏感性的初步研究顯示,過(guò)表達(dá)GOLPH3可能增加AKT的活化,減少對(duì)雷帕霉素的敏感,促進(jìn)細(xì)胞增殖。2009年Dippold等報(bào)道GOLPH3與高爾基體保持正常形態(tài)有關(guān)并有利于芽泡的生成。Wood等報(bào)道GOLPH3可與磷脂酰肌醇-4-磷酸(Ptdlns(4)P)結(jié)合,通過(guò)對(duì)高爾基體結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)來(lái)控制細(xì)胞內(nèi)囊泡的分泌及運(yùn)輸,由此說(shuō)明GOLPH3在高爾基體分泌泡形成和運(yùn)輸過(guò)程中起著重要的作用。目前的研究表明GOLPH3可參與細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、受體循環(huán)及糖基化等多種過(guò)程,作為一種癌蛋白發(fā)揮作用,這些過(guò)程與腫瘤的形成有潛在的聯(lián)系。自從第一次被證明是一個(gè)癌基因以來(lái),GOLPH3已被大量的研究報(bào)道,在許多腫瘤中,GOLPH3的上調(diào)和患者的不良預(yù)后有關(guān),可能通過(guò)多條信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,如mTOR/AKT通路或Writ通路等,因此GOLPH3可能是靶向藥物治療的有效基因靶點(diǎn)。NDRGl(N-myc downstream regulated gene 1)于1997年第一次被分離,在人體正常組織及腫瘤中均存在表達(dá),且同時(shí)也被發(fā)現(xiàn)參與了胚胎發(fā)生發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)分化、脂質(zhì)合成、髓鞘形成、應(yīng)激反應(yīng)和免疫功能等多個(gè)過(guò)程。目前發(fā)現(xiàn)NDRG1的表達(dá)受多種因素的調(diào)節(jié),包括N-myc基因,組蛋白乙酰化,缺氧,細(xì)胞內(nèi)鐵和鈣的水平等。多項(xiàng)研究已證實(shí),NDRG1在細(xì)胞分化過(guò)程中可被誘導(dǎo)產(chǎn)生,其表達(dá)上調(diào)會(huì)引起粒單細(xì)胞系增殖停止,表明NDRG1可在終末分化中起到作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),正常上皮細(xì)胞分化過(guò)程中其mRNA上調(diào),而在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)則下調(diào),提示其可能與細(xì)胞的分化和增殖有關(guān)。在腎臟中,PKD2通過(guò)EGR1轉(zhuǎn)錄因子而使NDRG1過(guò)表達(dá),來(lái)起到促進(jìn)增殖的作用。此外,NDRG1還和微管及中心體、紡錘體酯化以及多種P53相關(guān)基因息息相關(guān)。下調(diào)NDRG1和α-微管蛋白乙�；瘻p少有關(guān),微管蛋白的減少可影響紡錘絲的形成,并進(jìn)一步影響細(xì)胞分裂。此項(xiàng)研究證實(shí)NDRG1在細(xì)胞有絲分裂中存在保真性和抑制基因不穩(wěn)定性的作用,減少NDRG1的表達(dá)會(huì)使基因得不穩(wěn)定性增加,并可能進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤。近十余年來(lái),研究發(fā)現(xiàn),NDRG1在胰腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中低表達(dá),而在肝癌、子宮內(nèi)膜癌、膽管癌中卻發(fā)現(xiàn),NDRG1的蛋白表達(dá)較正常組織明顯增高,說(shuō)明對(duì)NDRG1的研究目前仍不一致。然而在膠質(zhì)瘤中,NDRG1的表達(dá)如何,且又發(fā)揮什么樣的生物學(xué)行為,目前國(guó)內(nèi)外研究較少,仍需要進(jìn)一步探討。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),GOLPH3和NDRG1均和高爾基體的囊泡運(yùn)輸有關(guān),GOLPH3定位在高爾基體可以促進(jìn)囊泡的分泌,而NDRG1定位在高爾基體周圍的胞漿,NDRG1也是TGN網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的一部分,可以促進(jìn)囊泡內(nèi)容物回收,幫助機(jī)體完成整個(gè)囊泡運(yùn)輸。磷脂酰肌醇-4-磷酸(PtdIns(4)P)是高爾基體結(jié)構(gòu)和功能的主要調(diào)節(jié)因素,Wood等報(bào)道GOLPH3可與PtdIns(4)P結(jié)合,并控制細(xì)胞內(nèi)囊泡的分泌,而NDRG1也能并口PtdIns(4)P相結(jié)合,通過(guò)反面高爾基體的ARF1參與細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸。另外,GOLPH3和NDRG1均和PI3K/Akt/mTOR通路、Wnt通路及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架、紡錘絲的形成有關(guān),但GOLPH3和NDRG1的具體關(guān)系仍需進(jìn)一步探討。為此,結(jié)合目前研究現(xiàn)狀,我們首先聯(lián)合檢測(cè)了GOLPH3和NDRG1在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)情況,分析了其與不同膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的關(guān)系,并在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中研究了GOLPH3和NDRG1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡、增殖的影響,且對(duì)其潛在的關(guān)系和機(jī)制進(jìn)行了探討。第一部分GOLPH3、NDRG1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及相關(guān)性的研究目的本實(shí)驗(yàn)研究GOLPH3、NDRG1分別在正常腦組織和人腦膠質(zhì)瘤組織不同病理級(jí)別中的表達(dá),并對(duì)其表達(dá)情況與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的關(guān)系進(jìn)行研究。方法本實(shí)驗(yàn)分為正常腦組織組、膠質(zhì)瘤Ⅱ級(jí)組、Ⅲ級(jí)組和Ⅳ級(jí)組,正常腦組織來(lái)自于腦外傷患者需要行顱內(nèi)減壓手術(shù)而取得的非壞死的正常腦組織標(biāo)本。應(yīng)用Real-time RT-PCR法和Western Blot法檢測(cè)34例人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和9例正常腦組織中的GOLPH3和NDRG1的mRNA和蛋白水平,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)9例正常腦組織標(biāo)本和76例人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中的GOLPH3和NDRG1表達(dá)情況,并分析兩種基因表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果1.在人腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中,GOLPH3和NDRG1在mRNA水平和蛋白水平均有表達(dá)。在人腦膠質(zhì)瘤中,GOLPH3的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均高于正常腦組織,且與正常腦組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),并隨著膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別的增高而增加。而NDRG1的mRNA和蛋白表達(dá)量在正常腦組織中表達(dá)較低,在人腦膠質(zhì)瘤Ⅱ級(jí)組中最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),在膠質(zhì)瘤組織中,隨著病理級(jí)別的升高,NDRG1的mRNA和蛋白表達(dá)水平逐漸降低。NDRG1的mRNA和蛋白在正常腦組織組和Ⅲ級(jí)組、Ⅳ級(jí)組中的表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在膠質(zhì)瘤組織中,GOLPH3和NDRG1在嬖RNA水平和蛋白水平的表達(dá)趨勢(shì)相反。2. GOLPH3的免疫組化結(jié)果顯示,GOLPH3的陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核旁,相當(dāng)于高爾基體位置,呈粗大顆粒狀,部分染色為細(xì)小顆粒狀,著色彌散存在于細(xì)胞質(zhì)中。GOLPH3在正常腦組織組和膠質(zhì)瘤組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為22.2%(2/9)、57.9%(44/76),兩者比較(x=4.124,P0.05);Ⅱ級(jí)組39.1%(9/23),Ⅲ級(jí)組54.2%(13/24), Ⅳ級(jí)組75.9%(20/29)。這說(shuō)明GOLPH3蛋白表達(dá)陽(yáng)性率在膠質(zhì)瘤組織中高于正常腦組織,且隨病理級(jí)別增高而升高。NDRG1的免疫組化結(jié)果顯示,NDRG1的陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),也有部分表達(dá)在細(xì)胞膜或細(xì)胞的連接部位。NDRG1在正常腦組織組和膠質(zhì)瘤組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為44.4%(4/9)、46.1%(35/76),兩者比較(x=0.008,P0.05)；Ⅱ級(jí)組60.9%(14/23),Ⅲ級(jí)組,41.7%(10/24), Ⅳ級(jí)組20.6%(7/29)。在腦膠質(zhì)瘤組織中,NDRG1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率隨病理級(jí)別增高呈降低的趨勢(shì)。NDRG1和GOLPH3的免疫組化陽(yáng)性率情況和Western-Blot檢測(cè)的蛋白表達(dá)趨勢(shì)是一致的。結(jié)論 1、GOLPH3和NDRG1在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中均有表達(dá)。在膠質(zhì)瘤組織中,GOLPH3的表達(dá)隨著腫瘤組織病理級(jí)別的升高逐漸升高,而NDRGl的表達(dá)隨著腫瘤組織病理級(jí)別的升高逐漸減低。2. GOLPH3和NDRGl在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。第二部分GOLPH3和NDRG1對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)機(jī)制的研究目的探討GOLPH3和NDRG1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡、增殖的影響及兩者之間的關(guān)系、可能機(jī)制,為膠質(zhì)瘤治療提供潛在的基因治療分子靶點(diǎn)。方法 1.在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251及U87中,用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染GOLPH3或NDRG1的siRNA,用Polyjet轉(zhuǎn)染GOLPH3或NDRG1的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。2.運(yùn)用Western Blot檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GOLPH3siRNA,NDRG1 siRNA、GOLPH3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及NDRG1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)U87、U251細(xì)胞凋亡的影響；CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果 1.下調(diào)GOLPH3或過(guò)表達(dá)NDRG1后,膠質(zhì)瘤U251、U87細(xì)胞的凋亡增多,增殖能力下降,過(guò)表達(dá)GOLPH3或下調(diào)NDRG1后,膠質(zhì)瘤U251、U87細(xì)胞的凋亡減少,增殖能力升高。2.在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系中下調(diào)GOLPH3后,NDRG1、cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)水平明顯增加,過(guò)表達(dá)GOLPH3后,NDRG1、cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)水平明顯減少。3.在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系中下調(diào)NDRG1, GOLPH3的蛋白表達(dá)水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)水平減少。結(jié)論1.下調(diào)GOLPH3或過(guò)表達(dá)NDRG1促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,減少增殖,而過(guò)表達(dá)GOLPH3或下調(diào)NDRG1則減少細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)增殖。GOLPH3和NDRG1均和膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡,增殖有關(guān),有可能成為膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)。2. GOLPH3可能位于NDRG1的上游,干擾GOLPH3可通過(guò)上調(diào)NDRG1并增加cleaved-caspase3的表達(dá)來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。
[Abstract]:Gliomas are the most common tumors in the central nervous system , accounting for 44.69 % of the intracranial tumors , the first in the incidence of intracranial tumors . GOLPH3 ( GOLPH3 ) plays an important role in the formation and transport of cancer proteins . It is suggested that GOLPH3 can be involved in the formation and transport of tumor cells . The expression of NDRG1 and NDRG1 is related to the differentiation and proliferation of NDRG1 . In addition , the expression of NDRG1 and NDRG1 is related to the cell differentiation and proliferation . Methods The mRNA and protein levels of GOLPH3 and NDRG1 in 34 human glioma specimens and 9 normal brain tissues were detected by Real - time RT - PCR and Western Blot .
The expression levels of GOLPH3 and NDRG1 in normal brain tissues were significantly higher than those in normal brain tissues ( P < 0.05 ) . The positive expression rates of GOLPH3 in normal brain tissue group and glioma group were 22.2 % ( 2 / 9 ) and 57.9 % ( 44 / 76 ) respectively . The positive expression rates of GOLPH3 in normal brain tissue group and glioma group were 22.2 % ( 9 / 23 ) , 54.2 % ( 13 / 24 ) and 75.9 % ( 20 / 29 ) respectively .
The positive rates of NDRG1 and NDRG1 were consistent with the pathological grade . Conclusion The expression of GOLPH3 and NDRG1 is consistent with the pathological grade . Conclusion The expression of GOLPH3 and NDRG1 is gradually increased with the pathological grade of tumor tissue , while the expression of NDRG1 decreases with the pathological grade of tumor tissue . The effects of GOLPH3 and NDRG1 on the proliferation , apoptosis and related mechanisms of human glioma cells were investigated . The effects of GOLPH3 and NDRG1 on apoptosis and proliferation of glioma cells were investigated .
Flow cytometry was used to detect the effects of GOLPH3 siRNA , NDRG1 siRNA , GOLPH3 overexpression plasmid and NDRG1 overexpression plasmid on apoptosis of U87 and U251 cells .
Results 1 . After downregulating GOLPH3 or overexpression of NDRG1 , the protein expression level of glioma U251 , U87 cells increased significantly , and the protein expression level of glioma U251 and U87 decreased significantly . GOLPH3 may be located upstream of NDRG1 and interfere with GOLPH3 to promote apoptosis of glioma cells by up - regulation of NDRG1 and increasing expression of caspase - caspase3 .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 丁響;陳謙學(xué);;GOLPH3在膠質(zhì)瘤中的研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2017年20期

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本文編號(hào)：1994164