發(fā)布時間：2018-06-05 16:48

  本文選題：HIF-1α + 電針�。� 參考：《第四軍醫(yī)大學》2014年博士論文

【摘要】：隨著我國人口老齡化問題的日益嚴重，缺血性腦中風的發(fā)生率日漸增加，但因為溶栓藥物的治療時間窗較窄及其副作用，僅有少部分患者接受溶栓治療，因而尋求更好的預防治療手段成為研究熱點。大量研究證實，電針預處理可以誘導腦缺血耐受效應，減輕腦缺血損傷，但其腦保護的相關機制尚未得到完整闡明。 低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）在缺血后神經(jīng)細胞凋亡及微循環(huán)的重建等方面發(fā)揮重要調控作用，HIF-1α及其下游基因產(chǎn)物在腦缺血損傷中的保護作用已被廣泛關注，但其在電針預處理腦保護中的作用及上下游調控機制尚不清楚。 本課題應用大鼠大腦中動脈阻閉模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模擬局灶性腦缺血損傷，研究HIF-1α在電針預處理誘導腦缺血保護效應中的作用及其機制，并對HIF-1α與Notch信號通路在腦缺血損傷中的相互作用關系進行探討，以期闡明電針預處理的腦缺血保護機制，為電針預處理的臨床應用提供新的理論依據(jù)。 第一部分 觀察電針預處理對缺血再灌注前后HIF-1α的影響 目的： 1.研究缺血再灌注損傷對HIF-1α表達的影響。 2.研究電針預處理對缺血再灌注前后HIF-1α表達的影響。 方法： 雄性SD大鼠96只，體重280~320g，，隨機分為兩組（n=48）：對照組（CON）和電針預處理組（EA），CON組動物僅建立MCAO模型（n=40），EA組動物接受連續(xù)5d電針刺激，每次30min，最后一次電針刺激后24h建立MCAO模型（n=40），分別于最后一次電針刺激后24h和缺血再灌注后2h，6h，24h，48h及72h處死大鼠取缺血半暗帶腦組織（n=8），Realtime PCR(RT-PCR)檢測缺血半暗帶中HIF-1α及HO-1mRNA水平，Western Blot檢測缺血半暗帶中HIF-1α蛋白表達情況，應用免疫熒光雙標染色定位觀察HIF-1α在腦內細胞分布情況。 結果： 1. RT-PCR檢測顯示：缺血再灌注前，CON與EA組中HIF-1α及下游靶基因HO-1mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義；缺血再灌注后，EA組HIF-1α及HO-1mRNA水平在再灌注后2h，6h及24h均顯著高于CON組(P0.05)，再灌注后48h及72h顯著低于CON組(P0.05)。 2. Western Blot檢測顯示：EA組HIF-1α蛋白表達在再灌注后2h較再灌注前顯著升高(P0.05，與缺血再灌注前比較)，并于再灌注后48h達到峰值，再灌注后2h，6h，24h及48h，EA組HIF-1α蛋白表達均顯著高于CON組(P0.05，與對照組比較)。 3.免疫熒光雙標染色顯示：HIF-1α陽性信號與神經(jīng)元標記物NeuN陽性信號存在共定位。缺血再灌注后24h，EA組HIF-1α陽性細胞及NeuN陽性細胞均顯著多于CON組(P0.05)，EA組缺血半暗帶中HIF-1α/NeuN雙標神經(jīng)元細胞數(shù)量也顯著多于CON組(P0.05)。 結論： 電針預處理能顯著上調缺血再灌注后缺血半暗帶中HIF-1α表達，且HIF-1α表達于缺血后神經(jīng)元細胞之上。 第二部分 觀察抑制HIF-1α表達對電針預處理誘導腦缺血保護的影響 目的： 1.研究HIF-1α抑制劑2ME2對電針預處理誘導腦缺血保護的影響。 2.探討HIF-1α在電針預處理誘導腦缺血保護中的作用機制。 方法： 雄性SD大鼠80只，體重280~320g，隨機分為五組（n=16）：假手術組（Sham），對照組(CON)，電針預處理組（EA），HIF-1α抑制劑組（2ME2）和電針預處理+HIF-1α抑制劑組（EA+2ME2）。Sham組動物接受相同的手術操作，但不插入線栓阻閉大腦中動脈；CON組，2ME2組，EA組及EA+2ME2組動物均建立MCAO模型。EA組及EA+2ME2組動物接受連續(xù)5d電針刺激，每次30min，最后一次刺激后24h建立MCAO模型；2ME2組及EA+2ME2組動物分別于MCAO模型制備前30min腹腔注射2ME2（16mg/kg）。缺血再灌注后24h，各組動物處死（n=8），TUNEL染色檢測神經(jīng)元凋亡，Western Blot檢測缺血半暗帶中Bcl2及Bax蛋白表達情況；缺血再灌注后72h，各組動物（n=8）評估神經(jīng)功能學評分后行MRI檢查，而后處死行TTC染色檢測腦梗死容積。 結果： 1.磁共振成像顯示：缺血再灌注后72h，Sham組大鼠T1及T2加權圖像均無腦梗死區(qū)顯像，T1加權圖像顯示腦梗死區(qū)效果不佳，EA組T2加權圖像中腦水腫程度顯著低于CON組（P0.05）。 2.神經(jīng)功能評分及TTC染色顯示：缺血再灌注后72h，與CON組比較，EA組神經(jīng)功能評分顯著改善(P0.05)，而2ME2可以顯著降低EA+2ME2組神經(jīng)功能評分(P0.05)。CON組和2ME2組神經(jīng)功能評分差異無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。腦梗死容積染色結果與神經(jīng)功能評分結果一致。 3. TUNEL染色顯示：缺血再灌注后24h，Sham組腦組織切片中未見TUNEL陽性細胞，而CON組和EA+2ME2組腦組織切片中TUNEL陽性細胞顯著多于EA組(P0.05)，CON組與2ME2組腦組織切片中TUNEL陽性細胞差異無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。 4. Western Blot檢測顯示：缺血再灌注后24h，與EA組比較，CON組及EA+2ME2組中Bcl-2蛋白表達顯著降低(P0.05)；而CON組中Bax蛋白表達顯著增加(P0.05)。CON組與2ME2組中Bcl-2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。 結論： HIF-1α抑制劑2ME2可以拮抗電針預處理誘導的腦缺血保護作用，HIF-1α可能通過抑制缺血后神經(jīng)元凋亡，上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，下調促凋亡蛋白Bax表達，參與電針預處理誘導的腦缺血保護作用。 第三部分 研究腦缺血損傷中HIF-1α與Notch信號通路的相互作用關系 目的： 1.研究腦缺血損傷中HIF-1α與Notch信號通路的活化是否一致。 2.探討HIF-1α在電針預處理腦保護中的活化是否受Notch信號通路調控。 方法： 雄性SD大鼠32只，體重280~320g，隨機分為四組（n=8）：對照組(CON)，電針預處理組（EA），電針預處理+γ分泌酶抑制劑MW167組（EA+MW167）和電針預處理+HIF-1α抑制劑2ME2組（EA+2ME2）。四組動物均建立MCAO模型；EA組，EA+MW167組及EA+2ME2組動物接受連續(xù)5d電針刺激，每次30min，最后一次刺激后24h建立MCAO模型；EA+MW167組動物于MCAO模型制備前30min側腦室注射MW167（1mM，10μL）；EA+2ME2組動物于MCAO模型制備前30min腹腔注射2ME2（16mg/kg）。缺血再灌注后24h，各組動物處死（n=8），免疫熒光雙標染色定位觀察HIF-1α及NICD在腦內細胞分布情況，Western Blot檢測缺血半暗帶中HIF-1α及Notch1NICD蛋白表達情況。 結果： 1.免疫熒光雙標染色顯示：HIF-1α陽性信號與NICD陽性信號存在共定位。缺血再灌注后24h，EA組缺血半暗帶中HIF-1α陽性細胞及NICD陽性細胞均顯著多于CON組(P0.05)，EA組缺血半暗帶中HIF-1α/NICD雙標陽性細胞數(shù)量也顯著多于CON組(P0.05)。 2. Western Blot檢測顯示：缺血再灌注后24h，與CON組比較，EA組缺血半暗帶中HIF-1α及NICD蛋白表達顯著增加(P0.05)；γ分泌酶抑制劑MW167阻斷Notch通路激活后，EA+MW167組缺血半暗帶中HIF-1α及NICD蛋白表達均較EA組顯著降低(P0.05)；而HIF-1α抑制劑2ME2僅降低HIF-1α蛋白表達(P0.05，EA+2ME2與EA比較)，對NICD蛋白表達無顯著影響(P0.05，EA+2ME2與EA比較)。 結論： 腦缺血損傷后，HIF-1α與Notch信號通路同時活化；電針預處理可能通過激活Notch信號通路，上調HIF-1α表達，產(chǎn)生腦缺血保護作用。
[Abstract]:With the increasing problem of population aging in China, the incidence of ischemic stroke is increasing, but because of the narrower time window and side effects of thrombolytic drugs, only a few patients receive thrombolytic therapy, so the search for better preventive treatment has become a hot point. Cerebral ischemic tolerance can alleviate cerebral ischemia injury, but its mechanism of brain protection has not been fully elucidated.
Hypoxia inducible factor 1 alpha (hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1 a) plays an important role in the regulation of neuronal apoptosis and the reconstruction of microcirculation after ischemia. The protective effect of HIF-1 alpha and its downstream gene products on cerebral ischemia injury has been widely concerned, but its role in electroacupuncture preconditioning and the mechanism of upstream and downstream regulation and control It's not yet clear.
In this study, middle cerebral artery occlusion (MCAO) was used to simulate focal cerebral ischemia injury, and to study the role and mechanism of HIF-1 alpha in the protection of cerebral ischemia induced by electroacupuncture preconditioning, and to explore the interaction relationship between HIF-1 A and Notch signaling pathway in cerebral ischemia injury. The protective mechanism of ischemic preconditioning by electro acupuncture provides a new theoretical basis for the clinical application of electroacupuncture pretreatment.
Part one
To observe the effect of Electro Acupuncture Pretreatment on HIF-1 alpha before and after ischemia-reperfusion.
Objective:
1. to study the effect of ischemia-reperfusion injury on the expression of HIF-1 alpha.
2. to study the effect of electroacupuncture pretreatment on the expression of HIF-1 alpha before and after ischemia-reperfusion.
Method錛

本文編號：1982728