本文選題：芒果苷 + 腦缺血再灌注��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：研究背景和目的 腦血管疾病是世界最常見的疾病之一,因其發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高的特點,嚴重威脅人類生命與健康。缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease, ICVD)指供應大腦血流的主要動脈發(fā)生狹窄或閉塞,結果導致腦組織(特別是大腦中動脈區(qū)域)急劇缺血缺氧,最終引起局部腦組織發(fā)生缺血或壞死,出現(xiàn)相應的臨床癥狀。缺血性腦卒中后可通過溶解血栓或機械再通的方式恢復缺血區(qū)的血液灌注,但一些病人在缺血后再灌注后不僅沒有使組織功能恢復,反而使缺血所致的功能障礙和結構破壞進一步加重,即我們所說的腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion (IR) injury)。腦缺血再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程,近來研究發(fā)現(xiàn),腦血流中斷和再灌注使腦的細胞產(chǎn)生損傷是一個快速的級聯(lián)反應,這個級聯(lián)反應包括許多環(huán)節(jié),如能量障礙、細胞酸中毒、興奮性氨基酸釋放增加、細胞內鈣失穩(wěn)態(tài)、自由基生成、凋亡基因激活等。這些環(huán)節(jié)互為因果,彼此重疊,并相互聯(lián)系,形成惡性循環(huán),最終導致細胞凋亡或壞死。目前雖然對腦缺血的病理生理機制研究取得重大進展,但治療選擇仍然有限。一種成功搶救缺血組織的治療方式是恢復再灌注,溶解血栓的重組組織型纖溶酶原激活劑型(recombinant tissue plasminogen activator, rt-PA)是唯一批準臨床使用的藥物,然而其時間窗有限(3h-4.5h),且造成出血并加重缺血再灌注損傷的風險。另一種方法則是以缺血級聯(lián)反應中的各個關鍵環(huán)節(jié)為靶點,阻斷其發(fā)展,達到神經(jīng)保護的目的。遺憾的是雖然目前許多神經(jīng)保護劑在動物實驗上能縮小腦梗塞體積并改善神經(jīng)功能,但沒有一種被證實臨床有效。 天然存在的抗氧化物質所具有的神經(jīng)保護作用近來成為人們關注的焦點。芒果苷(mangineferin, MAG)是一種天然的多酚類物質,廣泛存在于許多藥材如百合科植物知母以及芒果葉中。芒果苷分子中的四個芳香族羥基使其具有較強的抗輻射以及抗氧化作用。大量已發(fā)表的體內及體外研究表明芒果苷在炎癥、氧化應激、腫瘤生長、微生物感染、代謝調節(jié)、免疫調節(jié)以及輻射保護方面具有廣泛的藥理學活性。 本研究通過在整體動物水平和細胞水平上來建立神經(jīng)元缺血再灌注損傷模型,探討芒果苷對缺血性腦損傷的保護作用及其可能的機制,從而為芒果苷更安全、合理的應用于臨床提供理論依據(jù)。 研究方法 在整體動物實驗中,(1)采用線栓法阻塞大鼠中動脈(middle cerebral artery occlusion, MCAO),建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型,觀察MAG對腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能評分,評價造模是否成功。大鼠腦缺血2h,再灌注24h后,觀察存活大鼠行為變化,參考Zea-longa的5分制評分標準進行神經(jīng)行為學評分。在劑量研究中,將大鼠隨機分成6組：模型組、假手術組、陽性對照組(edaravone, Eda)、MAG各劑量組(5mg/kg、10mg/kg,20mg/kg)。假手術組除不插線外,其余步驟同上。假手術組與模型組均給予等體積生理鹽水。HE染色觀察組織形態(tài)學改變,觀察MAG對大鼠缺血大腦的梗塞面積及含水量的影響；(2)較長周期給藥實驗中,將大鼠隨機分成6組：模型組、假手術組、陽性對照組、MAG的高、中、低各劑量組,造模成功后分別于第2、4、6、8d,稱量體重,采用姿勢反射試驗、肢體不對稱試驗兩種方法作為行為學評價指標,觀察MAG對大鼠缺血再灌注損傷后運動功能康復的影響；(3)氧化應激生化指標的檢測：實驗大鼠分組同上。腦缺血2h,再灌注24h后,比色法檢測MAG對腦組織勻漿中丙二醛(malonaldehyde, MDA),還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性的影響；(4)炎癥生化指標的檢測：實驗大鼠分組同上。RT-PCR檢測MAG對腦組織勻漿中炎性因子腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)在轉錄水平表達的影響,隨后實驗采用ELISA法對上述兩種炎性因子在蛋白質水平加以測定；(5)體外培養(yǎng)PC12細胞,應用化學方法建立細胞氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation, OGD)損傷模型,觀察細胞形態(tài)學改變,并且應用四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法觀察不同濃度MAG對PC12細胞活力的影響,測定細胞外液乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)濃度。 研究結果 1.MAG對大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)行為學的影響 假手術組大鼠均無異常癥狀,行為評分為0；模型組動物出現(xiàn)不能完全伸展對側前爪,或向對側轉圈或向對側傾倒等的神經(jīng)損傷癥狀,其行為學評分與假手術模型組有顯著性差異(P=0.000)。芒果苷中劑量組、高劑量組與模型組相比可顯著降低行為學評分(P=0.023,P=0.030)。陽性對照組與模型組比較,行為學評分顯著改善(P=0.020)。而芒果苷低劑量組與模型組相比無顯著差異(P=0.818)。 2.MAG對大鼠腦缺血再灌注損傷大腦組織病理學的影響 組織形態(tài)學結果顯示：假手術組的大鼠腦組織細胞形態(tài)規(guī)則,連接緊密。模型組的大鼠細胞周圍間隙增寬,神經(jīng)細胞大小不等,毛細血管萎縮,神經(jīng)細胞腫脹,排列紊亂,細胞核呈深染固縮,部分胞質自溶,周圍出現(xiàn)較大空泡,缺血腦組織形態(tài)改變嚴重。各給藥組的大鼠均可見神經(jīng)細胞缺血性改變減輕,細胞輕度腫脹,間質較致密,壞死細胞數(shù)量減少。其中MAG高劑量組可見神經(jīng)細胞缺血性改變明顯減輕,血管周圍間隙和神經(jīng)細胞周圍間隙增寬明顯減輕,優(yōu)于模型組,壞死細胞數(shù)量明顯減少。 3.MAG對大鼠腦缺血再灌注損傷腦梗塞體積及水腫的影響 圖像分析行MCAO術后的大鼠腦冠切面,與假手術組相比,經(jīng)TTC染色后可見明顯且可重復出現(xiàn)的腦梗塞。假手術組的腦組織無梗塞。芒果苷低劑量處理組與模型組比較,無顯著性差異(P=0.093),芒果苷中、高劑量組均可顯著縮小缺血側腦組織梗塞體積(P=0.001,P=0.000)。陽性對照組與模型組比較,腦梗塞體積顯著降低(P=0.001)。與假手術組比較(62.46±0.63%),腦缺血所致的腦含水量顯著增高(65.81±1.81%)說明了腦水腫的存在,模型組的腦組織含水量顯著高于假手術組(P=0.000)；與模型組相比,芒果苷低、中、高劑量組(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)腦組織含水量顯著降低(P=0.006,P=0.000,P=0.000)。陽性對照組腦組織含水量顯著降低(P=0.000),與模型組相比有統(tǒng)計學意義。 4.MAG對大鼠較長時間給藥后體重及神經(jīng)功能恢復的影響 ①體重變化率：所有大鼠除假手術組外術后均體重下降。模型組由于缺血再灌注引起的損傷,造成體重呈下降趨勢。比較MCAO術后2、4、6、8d各組間體重變化率的差異,結果顯示與假手術組同時間點(1.49±8.70,4.61±7.55,7.54±6.83,11.65±6.99)比較,模型組MCAO術后第2d、4d、6d和8d體重變化率顯著降低(-10.36±2.55,-13.33±±6.05,-12.97±±7.61,-12.39±8.23),有顯著性差異(P均0.01)。與模型組比較,MAG高劑量組(20mg/kg)在造模后4、6d時可顯著改善缺血再灌注引起的體重下降(-5.34±10.30,-5.06±8.34),有顯著性差異(P均0.05)。MAG低、中劑量組(5、10mg/kg)及陽性對照組(6mg/kg)給藥后可改善缺血再灌注引起的體重下降,但無統(tǒng)計學差異(P均0.05)。 ②姿勢反射試驗：假手術組大鼠肢體功能正常,評分為O。MCAO術后第2d、4d、6d和8d各時間點與假手術組(0±0)比較,模型組有顯著性增加(1.90±0.13,1.71±0.32,1.74±0.22,1.41±0.43),具有顯著性差異(P--0.000)。與模型組比較,芒果苷低劑量組(5mg/kg)各時間點均無顯著性差異(P均0.05)外,中、高劑量組(10.20mg/kg)各時間點大鼠姿勢反射測量值均顯著下降(P均0.01)；與模型組比較,陽性對照組僅在2、6d兩個測量時間點對大鼠腦缺血引起的運動障礙有顯著的改善作用(P=0.000,P=0.000)。 ③肢體不對稱試驗：與假手術組(18.08±17.50,0±23.98,5±27.76,13.46±21.25)比較,造模后第2d、4d、6d和8d各時間點模型組前肢不對稱應用評分均顯著升高(68.89±21.33,52.78±33.36,48.89±35.16,52.78±30.01),具有顯著性差異(P=0.000)。比較MCAO術后2、4、6、8d時各組間肢體不對稱評分的差異,結果顯示與模型組比較,僅MAG高劑量(20mg/kg)在各個時間點均有顯著下降(P均0.01)；芒果苷低、中劑量組(5、10mg/kg)和陽性對照組(6mg/kg)雖然在MCAO術后能改善在各個時間點的肢體不對稱評分,但只有第2d和第8d有顯著意義(P均0.01)。 5.MAG對缺血再灌注大鼠腦SOD、GSH和MDA水平的影響 模型組腦缺血半球SOD活力顯著低于假手術組(P=0.007)；與模型組比較,MAG低、中、高劑量組(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)大腦SOD水平顯著高于模型組(P=0.050,P=0.011,P=0.001),表明芒果苷對腦缺血再灌注后腦組織SOD活力有一定恢復作用。陽性對照藥依達拉奉組大腦SOD活力顯著高于模型組(P=0.014)。 模型組大腦GSH含量顯著低于假手術組(P=0.000)；與模型組比較,僅高劑量組(20mg/kg)腦組織GSH含量顯著高于模型組(P=0.002),低、中劑量組(5mg/kg、10mg/kg)則無顯著性差別(P=0.994,P=0.171)；陽性對照藥依達拉奉組GSH含量顯著高于模型組(P=0.001)。 模型組大腦MDA含量與假手術組比較有顯著升高(P=0.000),表明缺血再灌注后腦組織脂質過氧化反應強烈,伴有腦組織自由基的聚積以及抗氧化酶活性的降低；與模型組比較,MAG低、中、高劑量(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)腦組織MDA含量顯著低于模型組(P=0.000,P=0.000,P=0.000),表明MAG對缺血再灌注后腦組織脂質過氧化反應有顯著抑制作用。陽性對照藥依達拉奉組MDA含量顯著低于模型組(P=0.000)。 6.MAG對缺血再灌注大鼠腦炎癥因子IL-1β,TNF-α的影響 定量RT-PCR分析顯示在假手術組中,腦組織IL-1βmRNA與TNF-α mRNA的表達較低,在缺血再灌注后均顯著上升。缺血2h,再灌注24h后,模型組缺血腦組織勻漿中IL-1β mRNA與TNF-α mRNA的表達均顯著高于假手術組(P=0.004,P=0.000)。與模型組比較,芒果苷低、中、高劑量組顯著降低IL-1pmRNA的表達(P=0.000,P=0.000,P=0.000),且呈一定劑量依賴性；與模型組比較,MAG低、中、高劑量組顯著降低TNF-α mRNA的表達(P=0.000,P=0.000,P=0.001)；陽性對照藥依達拉奉與模型組比較也顯著降低IL-1βmRNA與TNF-α mRNA的表達(P=0.001, P=0.000)。ELISA法在蛋白質水平也證實了上述對炎癥因子的抑制作用。 7.MAG對PC12細胞OGD損傷后細胞形態(tài)學的影響 正常對照組PC12細胞生長速度快,接種3d后,在倒置顯微鏡下可看到PC12細胞貼壁生長,形狀呈梭形、三角形,邊界清楚,胞漿豐富,突觸相互交織成網(wǎng)狀,折光性強,呈典型的神經(jīng)元形態(tài)。模型組細胞折光度減弱,細胞圓縮、脫落。模型中PC12細胞的損傷及藥物保護的形態(tài)學表現(xiàn)基本一致,MAG各組和陽性對照組的細胞損傷程度均有所減輕,呈現(xiàn)一定的藥物形態(tài)保護。 8.MAG對PC12細胞OGD損傷后細胞存活率及LDH漏出量的的影響 MAG低、中、高劑量組(5,10,20μM)及陽性對照藥依達拉奉(10μM)對氧糖剝奪模擬的缺血性損傷有明顯的神經(jīng)保護作用。與正常對照組比較,模型組細胞存活率顯著降低(P=0.000)。MAG各組呈劑量依賴性的提高細胞存活率,與模型組比較有顯著差異(P0.01)。與正常對照組比較,模型組細胞LDH釋放量顯著增加(P0.01)；而MAG各組呈劑量依賴性減少LDH釋放量,與模型組比較有顯著差異(P0.01)。陽性對照組提高細胞存活率,降低LDH漏出量,與模型組相比有統(tǒng)計學意義(P0.01)。 結論 MAG能夠在大鼠腦缺血再灌注后顯著升高腦組織中SOD活性和GSH含量,降低MDA含量,從而增強自由基清除能力,減輕脂質過氧化損傷；降低腦組織中炎癥因子IL-1β mRNA與TNF-α mRNA基因的表達,從蛋白質水平也證實了對上述兩個炎癥因子的抑制作用,從而顯示其抗炎作用；同時MAG還能增強氧糖剝奪損傷后PC12細胞的存活力,降低細胞上清中LDH含量。這些可能是MAG能改善腦缺血后大腦的組織形態(tài)學變化,縮小腦梗死面積,減輕腦水腫損傷,促進神經(jīng)功能恢復,有效治療局灶性腦缺血再灌注損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護作用的重要機制。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 鄧家剛;郭力城;鄭作文;楊柯;閻莉;;芒果苷對豚鼠肺組織釋放慢反應物質的影響[J];廣西中醫(yī)藥;2008年03期

2 毛燁;劉麗;王冬雪;;參芎注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠Fas、FasL蛋白表達的影響[J];黑龍江醫(yī)學;2008年08期

3 葉心國,李承晏,毛善平;急性腦梗死患者血清TNF-α、IL-1β和sICAM-1含量變化[J];中華急診醫(yī)學雜志;2003年01期

4 王超;王國賢;;芒果苷對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J];中國動脈硬化雜志;2008年09期

5 白紹蓓,常紅;天然抗氧化維生素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護作用的研究進展[J];中國全科醫(yī)學;2004年23期

6 劉啟鋒;劉明;劉玉河;陸南;;腦缺血再灌注損傷機制研究進展[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2006年06期

7 趙涓涓;柯國平;湯俊;黃娟;黎莉;;線栓法大腦中動脈閉塞所致局灶性腦缺血再灌注鼠模型的腦水腫和腦梗死比的變化[J];數(shù)理醫(yī)藥學雜志;2006年04期

8 劉霞;包翠芬;魏嘉;梁佳;秦書儉;;人參皂苷Rg1對抗腦缺血-再灌注大鼠腦組織FAS、FAS-L蛋白表達的定量分析[J];數(shù)理醫(yī)藥學雜志;2010年02期

9 胡偉東;胡耀祖;黃小平;;中藥有效成分對腦缺血再灌注損傷保護作用的研究進展[J];實用心腦肺血管病雜志;2010年01期

10 張予陽;呂娟;蘇醒;;神經(jīng)元鈣通道及鈣拮抗劑的抗腦缺血作用[J];沈陽藥科大學學報;2007年06期

，

本文編號：1956287