本文選題：葫蘆素B + 神經(jīng)母細(xì)胞瘤��； 參考：《華中科技大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma,NB)是一種顱外惡性實(shí)體腫瘤,在兒童中最為常見,又成為“兒童癌癥之王”。它起源于外周交感神經(jīng)系統(tǒng),是由發(fā)育中的脊髓外層遷移過來的神經(jīng)母細(xì)胞或原始神經(jīng)嵴細(xì)胞衍化而來的,占兒童癌癥死亡總數(shù)的10%左右。在臨床表現(xiàn)上,由于患者年齡大小、腫瘤發(fā)生部位、所處范圍以及生物學(xué)特征的不同,NB的臨床表現(xiàn)也是多種多樣,因此對(duì)患者的預(yù)后也有很大差異。目前NB的治療方法主要包括單純觀察、手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療以及生物治療等,根據(jù)患者所處的高、中、低風(fēng)險(xiǎn)分組的不同,治療強(qiáng)度也有所區(qū)別。盡管近年來隨著早期診斷技術(shù)的不斷的發(fā)展,NB患者的生存率也在顯著升高,但是高風(fēng)險(xiǎn)組患者的5年生存率依然很低。目前,化學(xué)治療在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療中仍然扮演著重要角色,由于化療給病人帶來的痛苦和副作用比較嚴(yán)重等原因,因而使尋找新型的高效低毒藥物成了目前迫在眉睫的任務(wù)。 葫蘆素B是從葫蘆科植物中分離出來的一種四環(huán)三萜化合物,具有多種藥理學(xué)作用,如抗病毒、抗炎及抗癌等活性。由于其具有顯著的抗炎活性,因此在傳統(tǒng)的使用上主要用于慢性肝炎的治療。最受廣泛關(guān)注的是葫蘆素B的抗癌活性,它在多種腫瘤細(xì)胞中能通過不同的分子作用機(jī)制抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,成為潛在的抗癌藥物。目前關(guān)于葫蘆素B對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的作用還未知,更沒有其對(duì)該腫瘤細(xì)胞作用機(jī)理方面的研究。因此,本文以體外培養(yǎng)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞為材料,首先對(duì)葫蘆素B對(duì)該細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行檢測(cè),并在此基礎(chǔ)上對(duì)葫蘆素B抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的分子作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究。主要研究結(jié)果如下： 1)葫蘆素B能通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G2/M期而抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的增殖。采用MTT法檢測(cè)了葫蘆素B對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示,葫蘆素B能濃度和時(shí)間依賴性的抑(?)SH-SY5Y細(xì)胞的增殖；PI單染后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了葫蘆素B處理24h后細(xì)胞周期分布的變化,發(fā)現(xiàn)隨著藥物處理濃度的增加,處于G2/M期細(xì)胞數(shù)目積累,細(xì)胞周期出現(xiàn)G2/M期阻滯。 2)葫蘆素B能誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生、線粒體膜去極化和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升。采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)了葫蘆素B對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果表明,葫蘆素B能夠濃度依賴性的誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡；使用倒置光學(xué)顯微鏡和Hoechst33258染色后熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示,經(jīng)過葫蘆素B處理前后細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)變化；DCFH-DA探針、JC-1熒光探針和Fluo-3AM熒光探針分別檢測(cè)了葫蘆素B處理前后細(xì)胞內(nèi)ROS、線粒體膜電位以及Ca2+等生理水平的變化,結(jié)果顯示,葫蘆素B處理后ROS出現(xiàn)積累,線粒體膜電位下降,胞漿內(nèi)鈣離子濃度上升,且均呈現(xiàn)藥物濃度依賴性。 3)葫蘆素B通過調(diào)控與G2/M期運(yùn)轉(zhuǎn)相關(guān)的蛋白及與凋亡相關(guān)的Bcl-2家族蛋白的表達(dá)水平來誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞周期阻滯和凋亡,同時(shí)還能濃度依賴性的上調(diào)p53和p21的表達(dá)以及下調(diào)與腫瘤血管生成和細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)。采用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)了葫蘆素B處理24h后,與細(xì)胞G2/M期運(yùn)轉(zhuǎn)和凋亡的相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的變化,結(jié)果顯示,葫蘆素B能夠濃度依賴性的抑制Cyclin B1、CDK1和Bcl-2的轉(zhuǎn)錄與翻譯水平,而上調(diào)凋亡蛋白Bax的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。此外,還檢測(cè)了葫蘆素B對(duì)caspase-3和9的活性以及p53和p21蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果表明,葫蘆素B也能濃度依賴性的活化caspase-3和9,并促進(jìn)p53和p21的表達(dá)。同時(shí)Western blot結(jié)果顯示,葫蘆素B還能抑制與血管生成相關(guān)的VEGF蛋白、與細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)的MMP-2, MMP-9和COX-2蛋白的表達(dá)。 4)葫蘆素B通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)來抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。JAK2/STAT3信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡中起著重要作用。因此,我們首先通過Western blot法檢測(cè)了葫蘆素B處理24h后該信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示,葫蘆素B能濃度依賴性的抑制p-JAK2和p-STAT3的表達(dá),而本底的JAK2和STAT3則沒有明顯的變化。使用該信號(hào)通路的抑制劑AG490和激活劑IL-6檢測(cè)了蛋白的變化,結(jié)果進(jìn)一步證明了葫蘆素B能顯著抑制該信號(hào)通路的激活。為了檢測(cè)該信號(hào)通路與細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系,采用了MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)了葫蘆素B和抑制劑、激活劑處理后細(xì)胞增殖率和凋亡率的變化,結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了葫蘆素B能夠通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活來抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖和凋亡。 5)MAPKs信號(hào)通路也參與調(diào)控葫蘆素B誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖抑制和凋亡。MAPKs在細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和分化與凋亡中也扮演重要角色。因此,通過Western blot法檢測(cè)葫蘆素B對(duì)該信號(hào)通路蛋白的影響,結(jié)果顯示,葫蘆素B能濃度依賴性的抑制ERK的激活,同時(shí)促進(jìn)JNK和p38MAPK的激活。通過使用以上三種蛋白的抑制劑PD98059、SP600125和SB203580檢測(cè)蛋白表達(dá)變化,進(jìn)一步證明葫蘆素B能誘導(dǎo)該信號(hào)通路的激活。MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)了該信號(hào)通路與葫蘆素B誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖抑制和凋亡的關(guān)系,結(jié)果表明MAPKs信號(hào)通路確實(shí)參與了葫蘆素B抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的過程。 綜上所述,本文的研究結(jié)果表明,葫蘆素B能夠在體外抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號(hào)：1934650