本文選題：FTY720 + 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤��； 參考：《南京大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率最高且惡性程度最高的腫瘤,患者生存期短,手術(shù)療效差,術(shù)后極易復(fù)發(fā),并且對放化療等多種治療手段耐受。因此,找到有效的治療策略,不僅可以有效的殺滅腫瘤細(xì)胞,抑制腫瘤復(fù)發(fā),并且可以改善患者的預(yù)后。FTY720是新近開發(fā)的一種免疫抑制劑,有文獻報道其在體內(nèi)、體外都有明確的抗腫瘤作用。FTY720不僅可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的凋亡、抑制肝細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移而且可以抑制裸鼠體內(nèi)實體腫瘤的生長。并且在前列腺癌中,FTY720除了誘導(dǎo)線粒體凋亡外還增加了腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性。此外,在胃癌、卵巢癌中,FTY720也有明確的抗腫瘤作用,但其具體的作用機制尚不明確。磷酯酰肌-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)家族參與多種信號通路。PI3K-蛋白激酶B (protein kinase B, AKT)信號通路包括PI3K、AKT、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin, mTOR)及p70S6K等分子。PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信號通路與正常細(xì)胞分化密切相關(guān),該通路的異常活化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用。研究表明,該通路與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為如凋亡、自噬、侵襲和轉(zhuǎn)移等有著密不可分的聯(lián)系。因此,我們推測FTY70是否通過PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信號通路在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮抗腫瘤的作用。我們通過體內(nèi)體外兩種模型,研究FTY720對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤凋亡、壞死、自噬、侵襲與遷移的影響以及PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信號通路在其中的作用。本課題共分成以下五個研究部分：第一部分FTY720對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤凋亡和壞死的影響目的：建立各種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系模型,完善細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代的方法。研究FTY720對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤凋亡和壞死的影響,同時區(qū)分FTY720誘導(dǎo)的凋亡是內(nèi)源性凋亡還是外源性凋亡。探索FTY720在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療中的潛在價值。方法：建立U251MG和U87MG膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系模型以及鼠和人原代神經(jīng)元模型,分別按照濃度梯度和時間梯度加入FTY720,通過Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測FTY720對腫瘤細(xì)胞有無殺傷作用。用二甲基亞砜(Dimethyl Sulphoxide, DMSO)或者15μMFTY720作用腫瘤細(xì)胞12小時后,通過Annexin V和propidium iodide (PI)染色判斷FTY720能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡或者壞死。腫瘤細(xì)胞用15μM FTY720作用不同的時間(0,3,6,12 h)或者用不同濃度的FTY720 (0,3.75,7.5,15μM)作用12小時后,通過Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3、poly (ADP-ribose) polymerase (PARP))和壞死相關(guān)蛋白(receptor-interacting protein 1、receptor-interacting protein 3 (RIP1、RIP3))的表達(dá)變化。腫瘤細(xì)胞用不同濃度的FTY720 (0,3.75,7.5,15μM)作用12小時后,通過蛋白印跡電泳(Western blot)區(qū)分FTY720誘導(dǎo)的凋亡是外源性凋亡(標(biāo)志物：caspase-8)還是內(nèi)源性凋亡(標(biāo)志物B-cell lymphoma 2 (Bcl-2)、B-cell lymphoma-extra large (Bcl-xL)、Bcl-2-associated X protein (Bax)、細(xì)胞色素c(cytochrome c))。結(jié)果：FTY720對U251MG和U87MG有明確的殺傷作用。Western blot結(jié)果顯示FTY720可以誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和PARP的裂解和壞死相關(guān)蛋白RIP1、RIP3的表達(dá),提示FTY720可以誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的凋亡和壞死。此外,FTY720作用后,外源性凋亡的標(biāo)志物裂解的caspase-8的表達(dá)顯著升高,而內(nèi)源性凋亡的標(biāo)志物Bcl-2、Bcl-xL、Bax和cytochrome c未見明顯變化,表明FTY720誘導(dǎo)的凋亡為外源性凋亡而非內(nèi)源性凋亡。結(jié)論：FTY720可以誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤外源性凋亡和壞死。第二部分FTY720對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬的影響以及自噬在FTY720誘導(dǎo)的凋亡和壞死中的作用目的：研究FTY720能否誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的自噬以及FTY720誘導(dǎo)的自噬和凋亡以及壞死的關(guān)系。方法：腫瘤細(xì)胞用15μMFTY720作用不同的時間(0,3,6,12h)或者用不同濃度的FTY720 (0,3.75,7.5,15μM)作用12小時后,通過Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3)、Beclin 1、自噬相關(guān)基因3(autophagy related 3, Atg3)、自噬相關(guān)基因5(autophagy related 5, Atg5)、自噬相關(guān)基因7(autophagy related 7, Atg7)、自噬相關(guān)基因12 (autophagy related 12, Atgl2)的變化。腫瘤細(xì)胞在DMSO或者15μMFTY720作用后,用抗LC3的一抗染色后再用相應(yīng)的熒光二抗染色,最后通過免疫熒光觀察FTY720作用后腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬點(LC3一般散在于細(xì)胞中,自噬體形成過程中,LC3會聚集于自噬體的表明,形成高亮的自噬點,通過LC3免疫染色可以觀察到)的變化。腫瘤細(xì)胞在DMSO或者15μMFTY720作用后,通過透射電鏡觀察腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成。腫瘤細(xì)胞在DMSO或者15μMFTY720作用后,再經(jīng)吖啶橙(acridine orange, AO)染色,最后通過熒光顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體的形成。細(xì)胞用不同濃度的FTY720作用12小時,通過Western blot檢測p62蛋白的變化。腫瘤細(xì)胞先用10 nM巴伐洛霉素Al (Bafilomycin Al, BafA1)作用1小時后再和15μMFTY720共同作用12小時,通過Western blot檢測p62和LC3蛋白的變化。腫瘤細(xì)胞用15μMFTY720和3 mM3-MA共同作用12小時后,用CCK-8檢測細(xì)胞存活率的變化,并且通過Western blot檢測使用FTY720和3-MA共同作用后自噬相關(guān)蛋白(LC3)和凋亡相關(guān)蛋白(caspase-8、caspase-3和PARP)的變化。腫瘤細(xì)胞先用Beclin 1 short hairpin RNA(shRNA)作用72小時后再加入15μMFTY720共同作用12小時,分別用CCK-8和Western blot觀察細(xì)胞存活率和凋亡相關(guān)蛋白(PARP)的變化。通過流式細(xì)胞儀檢測抑制自噬后(3-MA和下調(diào)Beclin 1后)凋亡(Annexin V)和壞死(PI)的變化。結(jié)果：FTY720作用后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251MG和U87MG內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg3、Atg5、Atg7、Atg12的表達(dá)升高；免疫熒光分析提示FTY720作用后腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬點明顯增多：透射電鏡觀察到FTY720作用后細(xì)胞內(nèi)有自噬體形成；FTY720作用后細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體的數(shù)量明顯增多；FTY720抑制了p62的表達(dá),且使用自噬抑制劑BafA1后進一步存進了p62的減少和LC3-II的增多。使用自噬抑制劑3-MA后FTY720誘導(dǎo)的U251MG和U87MG的細(xì)胞死亡明顯減少。此外,3-MA能減少FTY720誘導(dǎo)的LC3的轉(zhuǎn)化,caspase-8、caspase-3和PARP的裂解。慢病毒下調(diào)Beclin 1的表達(dá)后,FTY720誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也明顯減少了。流式細(xì)胞儀同樣檢測到抑制自噬后FTY720引起的Annexin V和PI陽性的細(xì)胞數(shù)量明顯減少,表明抑制自噬可以抑制FTY720誘導(dǎo)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的凋亡和壞死。結(jié)論：FTY720能顯著誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬并且FTY720誘導(dǎo)的自噬促進了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤凋亡和壞死。第三部分FTY720對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲與遷移的影響目的：研究FTY720能否抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲和遷移。方法：培養(yǎng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251MG和U87MG并種植于96孔板中。將FTY720分為0 μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6 μmol/L、7 μmol/L、8μmol/L九個濃度梯度組,分別加入至各孔中作用24小時后進行CCK-8增殖實驗,確定FTY720的給藥時間和濃度梯度。通過CCK-8增殖實驗確定FTY720的給藥時間和濃度梯度(24小時,0、1.5、3、6μmol/L)后進行細(xì)胞劃痕實驗,研究FTY720能否抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的遷移;進行Trans well侵襲與轉(zhuǎn)移實驗研究FTY720能否抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲和遷移；腫瘤細(xì)胞用不同濃度的FTY720(0,1.5,3 and 6 μM)作用24 h后通過Western blot觀察FTY720能否改變促進侵襲和遷移(matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), MMP-9)與抑制侵襲和遷移(tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1), TIMP-2)蛋白的表達(dá)。最后,腫瘤細(xì)胞用不同濃度的FTY720作用后,通過Western blot研究FTY720能否改變上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子(epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)-related factors)如roundabouts-1 (ROBO-1), Rhoassociated kinase-1 (ROCK-1), N-cadherin, E-cadherin和、imentin的表達(dá)。結(jié)果：FTY720的給藥時間和濃度梯度分別為24h,0、1.5、3、細(xì)胞劃痕實驗和Transwell侵襲與遷移實驗顯示FTY720能夠顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲和遷移；FTY720能夠下調(diào)MMP-2, MMP-9并上調(diào)TIMP-1, TIMP-2的表達(dá);FTY720能夠抑ROBO-1,ROCK-1,N-cadherin,vimentin并促進E-cadherin的表達(dá)。結(jié)論：FTY720能夠顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲和遷移。第四部分PI3K/AKT/mTOR信號通路在FTY720引起的膠質(zhì)母細(xì)胞生物學(xué)行為變化中的作用目的：研究FTY720是否通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路來誘導(dǎo)白噬、抑制侵襲和轉(zhuǎn)移。方法：腫瘤細(xì)胞用15μMFTY720作用不同的時間(0,3,6,12h)或者用不同濃度的FTY720 (0,3.75,7.5,15μM)作用12小時后,通過Western blot檢測FTY720作用后細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT/mTOR信號通路及其下游信號p70S6K的蛋白變化。腫瘤細(xì)胞先用10 μM PI3K抑制劑LY294002作用1,小時后再和FTY720共同作用,通過Western blot檢測p-AKT,AKT,LC3,MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2的表達(dá)變化。結(jié)果：FTY720顯著抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)AKT,mTOR和p70S6K的磷酸化水平,而對腫瘤細(xì)胞內(nèi)總的AKT,mTOR和p70S6K無明顯影響,表明FTY720抑制了PI3K/AKT/mTOR/p70S6K言號通路的活性；使用PI3K抑制劑LY294002和FTY720共同作用后,細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ, TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)進一步增多,而MMP-2，MMP-9的表達(dá)進一步減少。結(jié)論：FTY720通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路來誘導(dǎo)自噬和抑制侵襲、轉(zhuǎn)移的。第五部分FTY720對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤裸鼠種植模型的影響目的：研究FTY720能否在裸鼠體內(nèi)成瘤模型中發(fā)揮抗腫瘤的作用。方法：將U251MG和U87MG以5.0×106細(xì)胞/裸鼠的密度懸浮于100μl磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution, PBS)中,然后植入裸鼠皮下。當(dāng)腫瘤長至70到100 mm3的時候,每隔24小時腹腔注射生理鹽水或者含F(xiàn)TY720(5或10mg/kg)的生理鹽水,一共注射10天。之后再觀察10天腫瘤體積的變化。腫瘤體積計算公式為(長x寬2)x 0.52。再觀察10天腫瘤體積變化后將腫瘤剝離出來,通過Western blot檢測自噬(LC3)、凋亡(PARP)、壞死(RIP 1, RIP3)、侵襲和遷移(MMP-2, MMP-9)指標(biāo)的變化。結(jié)果：FTY720能顯著減少腫瘤的生長速度而對裸鼠的體重?zé)o明顯改變。FTY720作用后腫瘤組織內(nèi)LC3-Ⅱ, PARR, RIP1, RIPS的表達(dá)顯著升高,而MMP-2，MMP-9的表達(dá)降低。結(jié)論：FTY720可以抑制腫瘤的生長,誘導(dǎo)腫瘤組織的自噬、凋亡和壞死并且抑制侵襲和遷移。總結(jié)本課題研究結(jié)果從體內(nèi)體外兩方面證實了FTY720可以通過PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬、凋亡和壞死并且抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲和遷移。因此,FTY720可以為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療提供一個新的思路并且可以和其他抗腫瘤藥物聯(lián)用從而克服腫瘤耐藥,起到更好的抗腫瘤效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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本文編號：1881238