本文選題：癲癇持續(xù)狀態(tài) + γ-氨基丁酸能中間神經(jīng)元��； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：[背景]顳葉癲癇是成人患者中最為常見的癲癇類型,占局灶性癲癇的65%左右,近1/3的顳葉癲癇患者不能以現(xiàn)有治療方法進行有效的控制。除典型的反復(fù)出現(xiàn)的自發(fā)癇性發(fā)作外,顳葉癲癇患者通常還伴有認知障礙、情緒狀態(tài)以及社會適應(yīng)行為異常等表現(xiàn)。顳葉癲癇通常伴有顯著的海馬結(jié)構(gòu)組織病理學(xué)改變,表現(xiàn)為以CA1錐體細胞層細胞為代表的神經(jīng)元丟失、神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生、以苔蘚纖維出芽(mossy fiber sprouting)為特征的突觸重建、顆粒細胞離散化(dispersion)及齒狀回的神經(jīng)新生增強等。因此,海馬結(jié)構(gòu)尤其是齒狀回被認為在顳葉癲癇的形成中起關(guān)鍵作用。有關(guān)顳葉癲癇患者癇性發(fā)作形成的機制尚未完全闡明。在用于解釋癲癇形成的主要假說中,γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)能神經(jīng)抑制減弱這一假說最為著名。這一假說認為GABA能中間神經(jīng)元介導(dǎo)的神經(jīng)抑制減弱不僅促進癇性發(fā)作的形成,而且有利于癲癇波的播散,具有堅實的實驗基礎(chǔ)。齒狀回中,除興奮性細胞外,還存在GABA能抑制性神經(jīng)元分布。GABA能中間神經(jīng)元不僅能夠通過反饋和前饋機制維持齒狀回神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定,而且在認知功能上也起重要作用。與同一部位的興奮性細胞在形態(tài)、電生理學(xué)性質(zhì)以及功能上具有相對均一不同,GABA能中間神經(jīng)元具有顯著多樣性。不管是在臨床癲癇患者術(shù)后標(biāo)本還是在癲癇模型動物都觀察到齒狀回GABA能中間神經(jīng)元數(shù)目減少、形態(tài)和／或功能改變,只是出現(xiàn)改變的GABA能中間神經(jīng)元亞型及其減少的程度有差異。與GABA能中間神經(jīng)元數(shù)量改變相符,電生理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)有自發(fā)癇性發(fā)作的動物出現(xiàn)齒狀回GABA能抑制的減弱。上述發(fā)現(xiàn)支持齒狀回GABA能抑制減弱參與癲癇的形成。另外,除了GABA能中間神經(jīng)元活動減弱導(dǎo)致癲癇形成的傳統(tǒng)假說,已有實驗證據(jù)顯示GABA能中間神經(jīng)元的激活還可能導(dǎo)致癇性發(fā)作的出現(xiàn)。那些在受到刺激后不需要任何新蛋白合成而出現(xiàn)表達上調(diào)基因被稱為立早基因(immediate early genes, IEGs)。立早基因不管是在信使RNA水平還是在相關(guān)蛋白水平都可用來指示神經(jīng)元活動及其強度。研究報道顯示立早基因c-fos和活動調(diào)節(jié)細胞骨架相關(guān)蛋白(activity-regulated cytoskeleton associated protein, Arc or Arg3.1)在電休克刺激或者化學(xué)致癇藥物誘發(fā)的癇性發(fā)作中出現(xiàn)活動性表達上調(diào)。但對IEGs表達能否用于研究癇性發(fā)作后GABA能中間神經(jīng)元的激活尚未有結(jié)果。本課題使用大鼠匹羅卡品癲癇模型,在確認立早基因Arc和c-fos表達上調(diào)可用于反應(yīng)GABA能中間神經(jīng)元激活的基礎(chǔ)上,通過腦片膜片鉗記錄和檢測立早基因Arc和c-fos,研究了癲癇進展過程中齒狀回GABA能神經(jīng)元活動狀態(tài)的改變。[主要方法]癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE)的誘導(dǎo)通過腹膜腔內(nèi)注射匹羅卡品誘導(dǎo)SE。將體重160-180 g(鼠齡6-7周)的健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠進行稱重、分籠后,腹膜腔內(nèi)給予特布塔林和東莨菪堿各2 mg/kg。為減少造模過程中動物死亡率,匹羅卡品分兩次進行腹膜腔內(nèi)注射。第一次劑量(150mg/kg)在特布塔林和東莨菪堿注射后30分鐘后給予,第二次劑量(300mg/kg)在第一次注射的20分鐘后給予。對照組動物分別在匹羅卡品相同注射時間點給予兩次腹膜腔內(nèi)生理鹽水注射。在第二次劑量注射后開始觀察動物行為改變,以Racine分級判斷癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度。保留發(fā)作達Racine分級II級或以上以及連續(xù)發(fā)作時間2小時以上的動物進行后續(xù)實驗。多聚甲醛經(jīng)心臟灌流固定選取部分SE誘導(dǎo)后1小時、1周、2周以及10周以上(10-15周)和相同時間點的對照動物。稱重后,腹膜腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(80mg/kg)將動物麻醉。完全麻痹后,將動物固定,快速打開腹腔和胸腔,充分暴露心臟。將灌流針頭經(jīng)左心室插入主動脈、剪開右心房,快速灌注30-50 ml肝素生理鹽水(4單位/ml),隨后以4%多聚甲醛PBS溶液對動物進行約40分鐘的持續(xù)灌注(液體容積約為1 ml/kg)。灌流結(jié)束后將腦取出,以4%多聚甲醛PBS溶液在4℃下將腦后固定8-14小時。腦組織切片的制作將腦組織從4%多聚甲醛中依次轉(zhuǎn)移至10%蔗糖PBS溶液中4小時,15%蔗糖PBS溶液中8小時,20%蔗糖PBS溶液中4℃過夜。梯度沉糖脫水后,將腦置于大鼠腦模具中,制成含有完整海馬結(jié)構(gòu)的組織塊。將切好的腦組織塊用卵白蛋白-明膠-戊二醛混合物進行包埋。包埋好的腦組織塊用膠水粘于切片槽中,用振蕩切片機切成40μm厚的水平切片。將腹側(cè)海馬切片按順序收集到到預(yù)先加入1XPBS的48孔培養(yǎng)板中備用。Timm染色為確認模型制作的有效性,對部分動物的海馬切片進行了Timm染色。對SE誘導(dǎo)10周后和相同時間點的對照動物各3只麻醉后分別進行經(jīng)心臟灌流固定、取腦。腦組織在4%多聚甲醛中固定過夜后,以梯度增加的蔗糖溶液脫水、保護。將海馬結(jié)構(gòu)游離、快速冰凍后,用冰凍切片機制作30μm厚的水平腦切片。每隔6張取1張來自腹側(cè)海馬的腦片放置到PBS溶液中。將所取切片平鋪于用多聚賴氨酸包被的載玻片上,置于切片盒中干燥、備用。將Timm's染色液倒入切片盒中,放在26℃恒溫搖床中避光染色45分鐘。用雙蒸水清洗切片3次后,進行酒精梯度脫水、二甲苯透明。最后用中性樹膠封片,晾干,以光學(xué)顯微鏡進行圖像采集。免疫熒光染色將切片從1XPBS溶液轉(zhuǎn)移至含有驢血清的封閉液中,4℃封閉2.5個小時以阻斷非特異性結(jié)合位點。將切片轉(zhuǎn)移至稀釋好的各組一抗溶液(見材料與方法表格1.3)中4℃過夜。用1XPBS清洗切片3次,每次15分鐘。將腦片轉(zhuǎn)移至驢來源的由不同熒光色素標(biāo)識的兩種抗體中4℃下孵育2.5小時。用1XPBS清洗切片3次,每次15分鐘。將切片平展至載玻片上,用75%甘油PBS溶液封片。共聚焦成像與圖像分析用卡爾蔡司高靈敏度激光共聚焦顯微鏡LSM780對封好的切片進行拍攝。所有切片按照0.8倍圖像縮放首先以10倍物鏡拍攝并保存。隨后將物鏡轉(zhuǎn)至20倍,以1.0縮放,隨機在齒狀同門區(qū)選取三個部位進行掃描、保存圖像。所有圖像拍攝在相同的掃描參數(shù)下完成。用Adobe Photoshop將齒狀回門區(qū)背景色調(diào)暗,對陽性細胞進行計數(shù)。GABA能中間神經(jīng)元的激活百分率通過c-fos陽性GABA能中間神經(jīng)元數(shù)目/GABA能中間神經(jīng)元總數(shù)X100%進行計算,而GABA能中間神經(jīng)元不同亞群的激活則由c-fos陽性亞群細胞／相應(yīng)亞群陽性細胞總數(shù)X100%計算。新鮮腦片的制作SE誘導(dǎo)至少10周后或相似年齡對照動物,給予乙醚吸入充分麻醉、鍘刀斷頭。在冷卻至4℃、95%O2/5%C02飽和的高鎂人工腦脊液中快速將腦取出。用刀片將多余部分切除、制成含有腹側(cè)和大部分背側(cè)海馬結(jié)構(gòu)的腦組織塊。以快速膠粘劑將組織塊黏在切片槽底部,在95%02/5%CO2飽和的高鎂人工腦脊液中,用振蕩式切片機制成厚度為410 μm的水平面腦片。將切好的腦片轉(zhuǎn)移至恒溫(34.5℃).95%O2/5%CO2飽和的正常人工腦脊液中孵育30分鐘。孵育完成后,將腦片孵育于95%O2/5%CO2飽和的常溫人工腦脊液中保存?zhèn)溆�。膜片鉗記錄將單片腦片轉(zhuǎn)移至腦片記錄槽底部,以95%O2/5%CO2飽和的人工腦脊液持續(xù)灌注腦片。先以5倍物鏡發(fā)現(xiàn)齒狀回后,以60倍水鏡定位位于齒狀回門區(qū)有復(fù)數(shù)突起的疑似中間神經(jīng)元。高阻抗封接(2 GΩ)建立后,將細胞鉗制在-60 mV,記錄5分鐘以觀察細胞自發(fā)放電的有無以及其頻率。負壓吸破細胞膜進入全細胞記錄模式后,立即讀取靜息膜電位數(shù)值。待電極內(nèi)液和細胞內(nèi)液充分交換,給予細胞長度為200 ms、幅度為10 mV的超極化方波刺激,記錄細胞的電流波動。隨后,在電流鉗模式下,通過階梯電流注射,記錄放電。電流注射強度為-100 pA至300 pA,步增50 pA,每步時程為1秒。細胞被動電生理參數(shù)、閡電位、動作電位幅度、寬度以及后去極化電位等參數(shù)以PCLAMP10進行分析。生物素介導(dǎo)的細胞標(biāo)識和細胞顯像電生理記錄結(jié)束、緩慢將玻璃電極撤離細胞。將腦片轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛PBS溶液中在4℃下固定過夜。次日將腦片從4%多聚甲醛PBS溶液中依次轉(zhuǎn)移至10%蔗糖PBS、15%蔗糖PBS和20%蔗糖PBS溶液中進行梯度沉糖、脫水。在用卵白蛋白-明膠-戊二醛混合物包埋后,用振蕩切片機將腦片薄切至60 μm。將薄切后的腦片收集至1XPBS中保存?zhèn)溆�。將腦片轉(zhuǎn)移至含有2%過氧化氫和30%甲醇的水溶液中,室溫孵育90分鐘以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。用1XPBS清洗2次后,將其轉(zhuǎn)移至親和素-辣根過氧化物酶溶液中4℃下孵育過夜。用1XPBS清洗3次后,將腦片轉(zhuǎn)移到使用前配制的二氨基聯(lián)苯/過氧化氫/硫酸鎳銨混合液中浸泡5-6分鐘發(fā)色。顯色完成后,將切片置于雙蒸水中終止反應(yīng)。用雙蒸水反復(fù)清洗后,將切片平展于載玻片上、置室溫下干燥過夜。以酒精梯度脫水、二甲苯透明后,用中性樹膠將切片封入、鏡檢采集圖像。統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(Mean±SEM),P≤0.05視為有統(tǒng)計學(xué)差異。進行統(tǒng)計檢驗前,所有數(shù)據(jù)均以Kolmogorov-Smirnov檢驗判斷其分布特征。對符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)以非配對t檢驗進行比較,兩組以上的數(shù)據(jù)以單因素或雙因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)比較。單因素方差分析確認統(tǒng)計學(xué)差異存在后,以Dunnett法進行組間比較,雙因素方差分析后以Bonferroni post hoc檢驗進行組間比較。不符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)以曼-惠特尼U檢驗進行比較。[主要結(jié)果]1.SE誘導(dǎo)齒狀回苔蘚發(fā)芽苔蘚纖維主要分布于苔蘚纖維正常走行的門區(qū)和CA3區(qū),僅有極少量苔蘚纖維分布于顆粒細胞層。而在SE誘導(dǎo)十周后,致密的苔蘚纖維不僅在門區(qū)和CA3區(qū)存在,而且也出現(xiàn)于齒狀回顆粒細胞層乃至內(nèi)分子層,說明苔蘚纖維發(fā)芽的存在。2.在蛋白水平,SE伴隨立早基因表達的增加對急性癇性發(fā)作和SE誘導(dǎo)至少10周后動物齒狀回進行立早基因Arc和c-fos的免疫熒光雙染,結(jié)果顯示：在急性癇性發(fā)作終止后和SE誘導(dǎo)10周后,Arc和c-fos的表達均出現(xiàn)顯著上調(diào),但其上調(diào)的方式顯著不同。急性癇性發(fā)作1小時后,Arc和c-fos表達增強主要出現(xiàn)于顆粒細胞,而在SE誘導(dǎo)后10周以上的動物齒狀回,門區(qū)細胞中的Arc和c-fos表達顯著強于顆粒細胞。雖然Arc和c-fos的亞細胞分布不同,但不管是在對照動物還是SE誘導(dǎo)動物,在同一細胞中Arc和c-fos的表達強度在上述兩個時間點都是平行的。3.SE誘導(dǎo)后,齒狀回門區(qū)中間神經(jīng)元立早基因表達的改變呈雙向性使用四個不同時間點對照組和癲癇持續(xù)狀態(tài)組動物海馬切片,對c-fos與兩種常用的GABA能中間神經(jīng)元分子標(biāo)志物谷氨酸脫羧酶67 (glutamic acid decarboxylase 67, GAD67)以及GABA進行免疫熒光雙染。結(jié)果顯示：c-fos在GABA陽性中間神經(jīng)元的表達特征與c-fos在GAD67陽性細胞中的表達特征相似,但GABA的染色更強。對照組動物齒狀回GABA能細胞表達c-fos的百分率較低,且各時間點GABA能陽性細胞表達c-fos的百分率沒有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。而SE誘導(dǎo)后c-fos在GABA能神經(jīng)元表達的增加呈雙向性改變：急性癇性發(fā)作后誘導(dǎo)GABA能神經(jīng)元中c-fos表達增加,但SE誘導(dǎo)1周后降至對照水平,2周后再度增加,10周后c-fos在GABA能中間神經(jīng)元的表達最強、最廣泛。4.SE誘導(dǎo)10周后,c-fos在齒狀回GABA能中間神經(jīng)元的表達上調(diào)具有細胞亞型特異性SE誘導(dǎo)10周后,c-fos和中間神經(jīng)元神經(jīng)分子標(biāo)志物鈣網(wǎng)膜蛋白(calretinin,CR)、神經(jīng)元型一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS) 、神經(jīng)肽Y (neuropeptide Y, NPY)、生長抑素(somatostatin, SOM)和小白蛋白(parvalbumin, PV)雙染顯示：對照組中,各類中間神經(jīng)元亞群表達c-fos的百分比從最高PV陽性細胞27.1%至最低CR陽性細胞14.9%不等。SE誘導(dǎo)10周后,除CR陽性細胞外,其它神經(jīng)化學(xué)亞型的GABA能細胞表達c-fos的百分率均有顯著增加,CR, nNOS, NPY, SOM和PV分另別增加9.9%、16.3%、46.2%、30.3%和19.0%。5.SE誘導(dǎo)10周后多數(shù)門區(qū)中間神經(jīng)元出現(xiàn)自發(fā)放電對照組的9個細胞中包括1個籃狀細胞、3個全分子層細胞(TML)、3個門區(qū)聯(lián)合交通支相關(guān)細胞(HICAP)和2個門區(qū)穿通支相關(guān)細胞(HIPP),而SE誘導(dǎo)10周后的9個細胞中則包括1個籃狀細胞、3個TML細胞、2個HICAP和3個HIPP細胞。對照組中,細胞接觸式記錄檢測到9個細胞的2個細胞出現(xiàn)自發(fā)放電(22%)；而SE誘導(dǎo)10周后的9個中間神經(jīng)元中的8個細胞呈現(xiàn)自發(fā)放電(89%)。統(tǒng)計分析顯示SE誘導(dǎo)10周后的齒狀回GABA能中間神經(jīng)元自發(fā)放電頻率顯著高于相似時間點的對照組細胞。兩組細胞在靜息電位水平和閡電位水平上均無統(tǒng)計學(xué)差異。[結(jié)論]1.在匹羅卡品大鼠癲癇模型,經(jīng)歷潛伏期后存活下來的齒狀回門區(qū)GABA能中間神經(jīng)元呈持續(xù)激活。2.門區(qū)GABA能中間神經(jīng)元的持續(xù)激活具有亞型特異性。3. GABA能中間神經(jīng)元的持續(xù)激活反映了齒狀回網(wǎng)絡(luò)興奮-抑制平衡的脆弱性,這可能是一種導(dǎo)致癇樣活動產(chǎn)生的機制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742.1;R-332
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本文編號：1823208