發(fā)布時間：2018-03-31 13:46

  本文選題：慢性偏頭痛　切入點：PTEN　出處：《重慶醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的偏頭痛是神經內科中最多見的可致殘疾病中的一種，可以嚴重影響患者的生活質量，發(fā)作期處于感覺超敏狀態(tài)，以自發(fā)痛(spontaneous pain)、痛覺過敏(hyperakesia)及觸誘發(fā)痛(allodynia)為特點。而慢性偏頭痛一般由發(fā)作性偏頭痛經過數(shù)月到數(shù)年發(fā)展而成，其病理性進展可以通過中樞致敏(central sensitization)來解釋，電生理學和影像學的研究表明，慢性偏頭痛的發(fā)生與腦干進行性的異常變化有關。目前很多研究表明，慢性偏頭痛中樞高敏感性由NMDAR-NOS-NO介導。 N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)是興奮性遞質谷氨酸受體的一種類型，屬于離子型受體，，其廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)，在中樞神經系統(tǒng)中對神經元信號的傳遞和基因表達的調控起著重要作用，還是突觸可塑性及皮質和海馬神經元長時程增強效應的主要調控者。NMDAR是由NR1、NR2A-D及NR3A-B共7種亞單位組成的異四聚體，其中NR1是功能亞單位，NR2和NR3是調節(jié)亞單。NR2亞單位包括NR2A、NR2B、NR2C和NR2D四種，其中NR2B受體亞型在疼痛的產生及中樞性痛覺敏化形成和慢性偏頭痛形成等方面均有重要作用。由于NMDAR通道活性由蛋白激酶和磷酸化介導，所以慢性偏頭痛的維持很可能是由腦干三叉神經尾核中NR2B的磷酸化來介導。 NO是在偏頭痛發(fā)作時起關鍵性作用的一種媒介分子，可以使三叉神經系統(tǒng)各個水平的神經元活化，包括腦干中的三叉神經脊束核。NO體內供體包括鈣／鈣調蛋白依賴的結構型NOS(eNOS，nNOS)以及不依賴Ca的誘導型NOS(inducible NOS．iNOS）。在硬腦膜上滴入外源性NO供體硝酸甘油，可以引起大鼠三叉神經脊束核的神經元發(fā)生遲發(fā)型放電，而在體內中樞神經系統(tǒng)中，NO的合成主要與谷氨酸的釋放有關，釋放的谷氨酸激活NR促使Ca2+內流，胞漿內Ca2+濃度達到400nM時，就會激活nNOS，促進神經元NO的生成，最終引起偏頭痛。 第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase andtensin homology deleted on chromoso-me ten，PTEN)是一個近年來新發(fā)現(xiàn)的同時具有脂質和蛋白質雙重磷酸酶活性的抑癌基因，其廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)，不僅對神經系統(tǒng)的發(fā)育及正常功能的維持具有重要作用，同時與腦缺血、癲癇、藥物成癮性等神經精神障礙疾病的發(fā)生密切相關。有研究發(fā)現(xiàn),下調PI'EN可對谷氨酸通過NMDAR誘導的神經元損傷具有保護作用,但PTEN基因是否可通過調節(jié)NR2B磷酸化影響慢性偏頭痛的病理過程，目前尚未見相關報道。 本研究在已知NR2B-Tyr／NOS／NO通路很有可能是慢性偏頭痛發(fā)病的病理機制之一與慢性偏頭痛的中樞致敏主要發(fā)生在三叉神經脊束核的基礎上，利用RNAi重組腺病毒(AdR—siPTEN)下調偏頭痛大鼠模型三叉神經脊束核的PTEN基因，觀察其對慢性偏頭痛大鼠行為學的影響，同時探討PTEN是否可通過調節(jié)NR2B-Tyr影響NO的合成，繼而抑制慢性偏頭痛的維持。 材料與方法1動物分組及處理：以清潔級成年雄性Sprague—Dswley(SD)鼠為實驗對象，隨機分為4組。模型組：第一個月由硬腦膜注射炎性湯，每兩天一次，共14次，第二個月依Tassorelli法皮下注射硝酸甘油10mg/kg，每周一次，共4次，制作實驗性慢性偏頭痛大鼠模型。對照組：與模型組同步對照，以生理鹽水代替炎性湯硬腦膜注射及硝酸甘油皮下注射。模型干預組：自模型組造模成功后，在三叉神經脊束核處注射AdR-siPTEN以轉染模型組大鼠三叉神經脊束核。對照干預組：與模型干預組同步，在三叉神經脊束核處注射AdR-siPTEN以轉染對照組大鼠三叉神經脊束核。 2行為學與痛閾觀察：第9周時觀察模型組、對照組、模型干預組、對照干預組60min-90min內撓頭、咬尾、爬籠、往返運動的次數(shù)總和(每個癥狀出現(xiàn)1次計1分)。將Ectronic vorl Frey rigid tip探針安放于探針尖上，再刺激大鼠雙側眼眶周圍，逐漸施加壓力直到大鼠自動逃離，觀察此時的壓力值即為大鼠的機械性痛閾值。 3受試動物于轉染AdR-siPTEN后一周（第9周）分別斷頭處死，取大鼠三叉神經脊束核組織，液氮內保存。 4取大鼠三叉神經脊束核，作厚15μm連續(xù)冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察三叉神經脊束核中熒光蛋白的表達。 5RT-PCR法半定量檢測大鼠三叉神經脊束核組織PTEN mRNA的表達。 6Western印跡法：對標本進行提取蛋白、蛋白定量后，煮沸，電泳分離蛋白，然后轉膜，進行蛋白印跡，顯色后照相并進行灰度值分析。檢測大鼠三叉神經脊束核組織PTEN、NR2B-Tyr蛋白的表達。 7NOS測定試劑盒、NO測定試劑盒測定各觀察組三叉神經脊束核組織內NOS、NO含量。 結果1大鼠行為學與痛閾結果：模型干預組較對照組與對照干預組行為學改變無明顯差異(P0.05)，模型組較對照組與對照干預組行為學改變有明顯差異(P0.05)，模型干預組較模型組行為學改變也有明顯差異(P0.05)。痛閾結果與行為學類似。 2大鼠轉染腺病毒1周后，大鼠三叉神經脊束核組織出現(xiàn)紅色熒光蛋白陽性表達，表明PTEN基因腺病毒轉染成功。 3RT-PCR結果顯示PTEN mRNA的表達情況：與對照組相比，模型組PTEN mRNA表達無明顯差異(P0.05)。與對照干預組相比，模型干預組PTEN mRNA表達無明顯差異(P0.05)。對照干預組的PTENmRNA表達量為對照組的52.47%，具有顯著差異(P0.05)。模型干預組的PTEN mRNA表達量為模型組的53.22%，具有顯著差異(P0.05)。 4Western印跡法顯示PTEN、NR2B-Tyr蛋白的表達情況：PTEN蛋白在各組的表達與PTEN mRNA在各組的表達情況相似。與模型組相比，模型干預組NR2B-Tyr蛋白表達有明顯差異(P0.05)。與對照組相比，模型干預組NR2B-Tyr蛋白表達無明顯差異(P0.05)。對照組與對照干預組相比，NR2B-Tyr蛋白表達同樣有明顯差異(P0.05)。 5NOS、NO含量：與模型組相比，模型干預組NOS、NO表達有明顯差異(P0.05)。與對照組相比，模型干預組NOS、NO表達無明顯差異(P0.05)。對照組與對照干預組相比，NOS、NO表達也有明顯差異(P0.05)。 結論1慢性偏頭痛大鼠模型三叉神經脊束核NOS、NO含量及NR2B-Tyr蛋白表達明顯增加。 2轉染AdR-siPTEN后，慢性偏頭痛大鼠模型三叉神經脊束核PTEN mRNA及PTEN蛋白明顯降低，NR2B-Tyr蛋白表達明顯降低，NOS、NO含量明顯降低，表明下調PTEN基因對慢性偏頭痛大鼠具有一定保護作用。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R747.2

【參考文獻】

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1 陳力學;姜利人;劉寶松;龍在云;康格非;;PTEN表達下調對神經元缺氧損傷的保護及其作用機制[J];第三軍醫(yī)大學學報;2006年19期

本文編號：1691000