本文選題：糖尿病　切入點：痛覺過敏　出處：《蘇州大學》2015年博士論文

【摘要】：研究背景糖尿病神經病變是糖尿病最常見也是最易致殘的慢性并發(fā)癥之一,其發(fā)生率根據診斷標準和檢測方法的不同,患病率在10%~96%不等(中國2型糖尿病防治指南2013版)。其最常見的類型是周圍神經病變,其次為糖尿病自主神經病變。周圍神經病變常表現(xiàn)為遠端肢體對稱性的麻木感,部分患者會出現(xiàn)異常疼痛,包括自發(fā)痛、痛覺過敏(輕度刺激引起劇烈疼痛)和痛覺超敏(無害刺激如光照、觸摸時也能引起明顯疼痛)等,稱為糖尿病神經病理性疼痛。而自主神經病變主要影響心血管、胃腸及泌尿生殖系統(tǒng)功能。當累及上消化道時,常導致患者出現(xiàn)上腹痛或不適、惡心嘔吐、反酸燒心、餐后飽脹等一系列癥狀,同時具有胃部痛覺過敏現(xiàn)象,表現(xiàn)為胃對胃酸、炎癥或擴張等刺激的反應性明顯增加。目前糖尿病神經病變的發(fā)病機理尚未完全闡明,亦缺乏有效的臨床治療手段,顯著影響著糖尿病患者的生活質量。進一步研究其機制,對于尋找有效的治療靶點非常重要。第一部分1.研究目的闡明核因子-κB在糖尿病胃部痛覺過敏形成中的作用及相關機制,主要研究內容包括:(1)探討糖尿病大鼠是否存在胃部痛覺過敏及其相關電生理機制。(2)探討CBS-H2S系統(tǒng)是否參與糖尿病大鼠胃部痛覺過敏的形成。(3)探討NF-κB對CBS-H2S系統(tǒng)的調控作用及相關機制。2.實驗方法(1)選用雌性成年SD大鼠作為實驗動物,應用STZ(65mg/kg)腹腔單次注射誘導糖尿病模型。應用胃部球囊擴張及肌電圖分析技術,檢測大鼠的胃部感覺。(2)應用全細胞膜片鉗技術記錄大鼠胃特異性DRG神經元的興奮性及硫化氫對胃特異性DRG神經元興奮性的影響。(3)應用Real-time PCR和Western blotting方法檢測大鼠胃特異性DRG中NF-κB、硫化氫合成酶CBS、DNA甲基化相關酶的表達水平。(4)應用甲基化特異性PCR(MSP)和亞硫酸氫鹽處理測序法(BSP)檢測大鼠胃特異性DRG神經元中cbs基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。(5)應用免疫熒光染色法觀察NF-κB與CBS在胃特異性DRG神經元上的表達情況。(6)應用染色質免疫共沉淀(CHIP)法檢測大鼠胃特異性DRG中NF-κB與cbs基因啟動子區(qū)的結合度。3.實驗結果(1)STZ腹腔注射后2-6周糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯的胃部痛覺過敏,第4-6周痛敏最為明顯。STZ注射后第4周,糖尿病大鼠胃特異性DRG神經元興奮性明顯增加。(2)糖尿病大鼠胃特異性DRG中CBS表達增加。腹腔注射CBS抑制劑AOAA能夠緩解糖尿病大鼠胃部痛覺過敏,并呈劑量依賴性。腹腔注射AOAA能夠降低糖尿病大鼠胃特異性DRG神經元的興奮性。H2S衍生劑Na HS能夠增加DRG神經元興奮性。(3)NF-κB與CBS共表達于大鼠胃特異性DRG神經元中,糖尿病大鼠胃特異性DRG中NF-κB與cbs基因啟動子區(qū)結合度增加。腹腔注射NF-κB抑制劑PDTC能夠下調糖尿病大鼠胃特異性DRG中CBS的表達。糖尿病大鼠胃特異性DRG中cbs基因啟動子區(qū)明顯去甲基化,DNA甲基轉移酶3a、3b表達下調。4.小結(1)糖尿病大鼠存在胃部痛覺過敏,并與胃特異性DRG神經元興奮性增加有關;(2)糖尿病狀態(tài)下,胃特異性DRG神經元中CBS的表達上調,增加H2S的合成,致敏神經元,參與糖尿病胃部痛覺過敏的形成;(3)糖尿病狀態(tài)下,活化的NF-κB可以在轉錄水平上調CBS的表達;cbs基因啟動子區(qū)去甲基化增強,使得NF-κB與cbs基因啟動子區(qū)的結合成為可能,并發(fā)揮其轉錄調控作用。第二部分1.研究目的闡明核因子-κB在糖尿病后肢痛覺過敏形成中的作用及相關機制,主要研究內容包括:(1)探討轉錄因子NF-κB是否參與糖尿病大鼠后肢痛覺過敏的形成。(2)探討配體門控通道P2X3受體是否參與糖尿病大鼠后肢痛覺過敏的形成。(3)探討NF-κB對P2X3受體的調控作用及相關機制。2.實驗方法(1)選用雌性成年SD大鼠作為實驗動物,應用STZ(65mg/kg)腹腔單次注射誘導糖尿病模型。應用Von frey filament(VFF)和熱刺激儀定量檢測大鼠的后肢痛覺閾值。(2)應用全細胞膜片鉗技術記錄大鼠后肢特異性DRG神經元ATP誘導的的電流密度。(3)應用Real-time PCR和Western blotting方法檢測大鼠后肢特異性DRG中NF-κB、P2X3(及P2X1,P2X2)、DNA甲基化相關酶的表達水平。(4)應用甲基化特異性PCR(MSP)和亞硫酸氫鹽處理測序法(BSP)檢測大鼠后肢特異性DRG神經元中p2x3基因啟動子區(qū)的甲基化程度。(5)應用免疫熒光染色法觀察NF-κB與P2X3在后肢特異性DRG神經元上的表達情況;觀察攜帶GFP的慢病毒對后肢特異性DRG神經元的轉染情況。(6)應用染色質免疫共沉淀(CHIP)法檢測大鼠后肢特異性DRG中NF-κB與p2x3基因啟動子區(qū)的結合度。3.實驗結果(1)STZ腹腔注射后2周大鼠出現(xiàn)后肢機械痛敏及熱痛敏,并至少持續(xù)至第9周,第4-6周痛敏最為明顯。STZ注射后第4周,糖尿病大鼠后肢特異性DRG中NF-κB表達增加。腹腔注射NF-κB抑制劑PDTC或鞘內注射NF-κB si RNA慢病毒均能夠緩解糖尿病大鼠的后肢機械痛敏和熱痛敏。(2)鞘內注射P2受體拮抗劑suramin或P2X3受體拮抗劑A-317491均能緩解糖尿病大鼠后肢痛覺過敏,并呈劑量依賴性。糖尿病大鼠后肢特異性DRG中P2X3受體表達增加(而非P2X1或P2X2)。糖尿病大鼠后肢特異性DRG神經元ATP誘導的電流密度明顯增加。(3)NF-κB與P2X3受體共表達于大鼠后肢特異性DRG神經元中,糖尿病大鼠后肢特異性DRG中NF-κB與p2x3受體基因啟動子區(qū)結合度增加。鞘內注射NF-κB si RNA慢病毒能夠下調糖尿病大鼠后肢特異性DRG中P2X3受體的表達,并降低ATP誘導的電流密度。糖尿病大鼠后肢特異性DRG中p2x3受體基因啟動子區(qū)明顯去甲基化,DNA甲基轉移酶3b表達下調。4.小結(1)NF-κB參與糖尿病大鼠后肢痛覺過敏的形成;(2)糖尿病狀態(tài)下,后肢特異性DRG神經元中P2X3受體的表達及功能增加,參與糖尿病大鼠后肢痛覺過敏的形成;(3)糖尿病狀態(tài)下,活化的NF-κB可以在轉錄水平調控P2X3受體的表達;p2x3基因啟動子區(qū)域去甲基化,使得NF-κB與p2x3基因啟動子區(qū)的結合成為可能,并發(fā)揮其轉錄調控作用。結論(1)糖尿病大鼠存在胃部痛覺過敏及后肢痛覺過敏,并分別與各自特異性DRG神經元的敏化有關。(2)NF-κB分別通過調控痛相關基因(cbs和p2x3)的表達,致敏胃特異性及后肢特異性DRG神經元,導致胃部痛覺過敏及后肢痛覺過敏。(3)DNA甲基化參與NF-κB對痛相關基因cbs及p2x3的表達調控。
[Abstract]:Objective To study the role of NF - 魏B in the pathogenesis of diabetic neuropathy . ( 2 ) To investigate the effect of NF - 魏B on gastric pain in diabetic rats . ( 1 ) The expression of NF - 魏B and cbs gene promoter region in diabetic rats was significantly increased by intraperitoneal injection of AOAA . ( 4 ) The expression of p2x3 gene promoter in hind limb specific DRG of diabetic rats was increased . The expression of P2X3 receptor in hind limb specific DRG of diabetic rats was increased . ( 3 ) The expression of P2X3 receptor in hind limb specific DRG of diabetic rats was increased . ( 3 ) NF - 魏B and P2X3 receptor antagonist A - 317 491 could regulate the expression of P2X3 receptor in hind limb specific DRG of diabetic rats .

【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R747.9

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