本文選題：分子影像　切入點：炎癥　出處：《復旦大學》2014年博士論文

【摘要】：分子影像(Molecular Imaging)是指通過影像學的方法,無創(chuàng)性的檢測細胞和(或)分子水平的主要事件,了解體內特異性基因或者蛋白表達部位、水平、分布及持續(xù)的時間。分子影像的發(fā)展主要依賴以下條件的發(fā)展：1.具有臨床意義的靶點；2.適合靶點的分子探針及適當的信號放大機制；3.高敏感度及分辨率的成像設備或混合成像設備。分子影像的靶點需要是機體有意義的生理及病理情況下大量表達的某種物質。神經炎癥由于參與多種中樞神經系統(tǒng)疾病,一直是分子影像靶點探索和成像研究的熱點之一。神經炎癥是指神經系統(tǒng)在感染,創(chuàng)傷,中毒或自身免疫啟動等情況下,循環(huán)的外周免疫細胞跨越抵抗力減弱的血腦屏障(Blood-brain barrier, BBB),釋放多種酶來誘導并參與的炎癥過程。髓過氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)是參與炎癥反應的酶中比較關鍵的一種,是許多活化了的白細胞強有力的炎性介質。MPO以氯離子和中性粒細胞產生的過氧化氫為底物,催化產生次氯酸和多種自由基。如果機體不能有效清除這些氧化劑和自由基,便引起多種病理過程和組織損傷。因此,MPO的活性可以反映神經炎癥活動性,可以作為示蹤神經炎癥參與的中樞神經系統(tǒng)疾病活動性的成像靶點。分子探針是指底物與能產生影像學信號的物質以特定方法結合而構成的一種復合物。目前,分子探針大多為靶向性探針,利用特異性探針與靶目標結合而成像,主要用于感興趣分子的在體分布情況的顯示。其中,可激活的探針,又稱為智能探針,由于探測或參與特異的分子事件并被激活而成像,對分子事件具有很好的特異性,并達到對靶事件的功能性顯示。對于探針的檢測,各種設備各有利弊。磁共振成像(Magnetic resonance imaging, MRI)具有很高的空間分辨率,適用于中樞神經系統(tǒng)疾病的探索,但其檢測敏感性較低,需要大量對比劑在靶組織內聚集及強大的信號擴增系統(tǒng)。與此相比,光學分子成像具有敏感性高、可實時成像等優(yōu)點,且無創(chuàng)傷、價格低,可對磁共振成像信息進行補充。本研究擬以神經炎癥中的關鍵酶MPO為靶點,構建MPO可特異性激活的磁共振智能探針及熒光智能探針,并對其在示蹤中樞神經系統(tǒng)活動性炎性病灶的應用進行研究。且擬利用熒光成像對淋巴細胞的進行體外示蹤初步探討,為多模態(tài)成像奠定基礎。第一部分靶向MPO的磁共振成像評估多發(fā)性硬化聯合治療的動物模型研究目的：醋酸格拉默(Glatiramer acetate, GA)通過產生免疫抑制性Th2淋巴細胞被用于治療MS; 4-Aminobenzoic acid hydrazide (ABAH)是一種特異性MPO酶活性抑制劑。本研究擬以MPO為靶點,通過MPO特異性分子探針磁共振成像評估兩種藥物聯合治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)動物模型的療效。材料與方法：SJL小鼠皮下注射髓鞘蛋白脂質蛋白(Proteolipidprotein, PLP)誘導EAE模型小鼠110只。記誘導當天為第0天,急性期為第10天,追蹤至第20天。小鼠隨機分為4組,生理鹽水對照組200 μL, bid (n= 5), ABAH組20mg/kg, bid (n= 30), GA 75μg, qd組 (n=30)及ABAH 20mg/kg, bid及GA75μg,qd聯合治療組(n=40)。5只假手術小鼠經同樣方式誘導,但用PBS代替PLP。每天2次進行臨床評分評估,并觀察小鼠生存率。合成MPO可特異性激活的智能探針bis-5HT-DTPA-Gd (MPO-Gd),選擇急性期不同治療組小鼠行磁共振T1WI平掃及增強掃描。結合平掃及增強后60min圖像分析病灶的數目,病灶體積及病灶對比噪聲比。成像小鼠行HE,抗MPO及堅考藍染色,評估病灶的炎性浸潤,MPO表達及脫髓鞘程度。統(tǒng)計采用Student's t-test, P0.05視為有統(tǒng)計學差異。結果：EAE小鼠模型誘導成功。觀察至急性期,可見聯合治療組小鼠發(fā)病晚,且疾病嚴重程度明顯輕于單藥治療組(ABAH P0.001, GA P0.05)。觀察至第20天,綜合整個疾病進程,聯合治療組臨床評分低,且疾病嚴重程度明顯輕于單藥治療組(ABAH P0.05, GA P0.05),生存率也高。在急性期成像,分析不同治療組小鼠的平掃及MPO-Gd增強6Omin影像結果顯示,聯合治療組的病灶數目減少(ABAH P0.01, GA P0.05),病灶的體積明顯減小(ABAH P0.05,GAP0.05)；對比噪聲比也明顯減低(ABAH P0.01, GA P0.05)。病理結果同樣顯示聯合治療組腦內炎性細胞的浸潤,MPO的表達及髓鞘破壞的程度均減低。結論：本部分實驗證實了GA與ABAH低劑量聯合治療較單藥治療效果好。以MPO為靶點的MPO-Gd智能探針MR成像通過示蹤腦內活動性病灶,準確反映這一療效,同臨床表現及病理結果相符。第二部分髓過氧化物酶特異性熒光探針的特性探索及初步應用目的：基于MPO-Gd分子探針合成原理,為擴展MPO為靶點的分子成像應用范圍,本實驗擬合成一種MPO可激活的酶活性智能熒光探針,并對其在體內外靶向炎性病變的特性及應用進行初步探索。材料與方法：以5-羥色胺(5-Hydroxy tryptmamine,5-HT)為底物,接以生物素基團合成MPO可激活的熒光探針,進而通過接以熒光基團的鏈酶親和素同探針中生物素的特異性結合對MPO進行成像。體外,包埋及未包埋人MPO的基質膠鋪于96孔板中,按順序分別加入熒光探針,清洗；加入不同濃度鏈酶親和素熒光復合物,清洗,對基質膠行熒光成像。在體,將包埋不同濃度人MPO的基質膠注入小鼠皮下,并尾靜脈分別注入MPO探針及鏈酶親和素熒光復合物。肺炎鏈球菌皮下注射制作小鼠皮下細菌感染模型,同樣經尾靜脈注入MPO探針和鏈酶親和素熒光復合物,并皮下注入Sytox Green綠色熒光蛋白來檢測局部炎性粒細胞凋亡情況。以上動物模型分別在注入熒光探針后0,15,30,45,60min行熒光成像。沙門氏桿菌脊髓鞘內注射制作小鼠腦膜炎感染模型,分離腦單個核細胞行流式細胞術分析腦內髓系細胞浸潤情況,并取腦組織分析MPO活性。同樣尾靜脈注入MPO探針和鏈酶親和素熒光復合物,60min后取腦組織,離體熒光成像。結果：MPO特異性熒光探針可以成功合成。體外基質膠實驗熒光成像可見MPO陰性的基質膠熒光成像為陰性,而MPO陽性的基質膠內各孔可見熒光強度升高,且升高程度同鏈酶親和素熒光復合物的濃度趨勢相同。說明MPO探針可被激活并發(fā)生局部寡聚化,且生物素-鏈酶親和素兩步法熒光成像可行。小鼠皮下包埋MPO基質膠成像可見MPO陽性基質膠部位熒光強度明顯升高,且信號的強度升高趨勢同MPO濃度升高趨勢相關(r2=0.9572)。肺炎鏈球菌皮下感染小鼠的60min熒光成像可見MPO探針可靶向聚集到感染部位,呈現紅色熒光,同局部凋亡中性粒細胞的綠色熒光相吻合,說明局部激活的炎性細胞凋亡,釋放MPO并可被MPO熒光探針檢測到。鞘內注射沙門氏桿菌的腦膜炎小鼠造模后24小時,流式細胞術分析可見腦內存在大量髓系細胞的浸潤。病變腦MPO活性結果顯示腦膜炎小鼠腦內MPO活性明顯升高,說明腦膜炎小鼠建模成功。模型小鼠腦組織離體熒光成像可見病變腦膜呈明顯條狀強化,而正常鼠腦未出現此強化。說明MPO探針可跨越血腦屏障,為中樞的MPO激活而顯像。結論：本部分實驗中,我們成功合成一種新的MPO可以激活的酶活性熒光探針,其同鏈酶親和素熒光復合物兩步法成像可行。體外及在體(中樞及外周)熒光成像表明此探針可特異性靶向MPO存在部位,進而對活動性炎性病灶成像。第三部分 熒光示蹤細胞毒性T淋巴細胞免疫治療膠質瘤初探目的：利用熒光成像的高敏感性優(yōu)勢,本研究擬通過對小鼠T淋巴細胞表面生物素化,通過鏈酶親和素熒光復合物間接對T淋巴細胞靶向生物素化膠質瘤干細胞進行體外熒光示蹤,并對其特異性靶向殺傷作用進行初步探索。材料與方法：小鼠脾臟陽性選擇分離CD8陽性T淋巴細胞并刺激增殖1-2天,得到激活的細胞毒性T淋巴細胞。慢病毒轉染法激活的細胞毒性T淋巴細胞進行生物素化并分析轉染效率。Sulfo-NHS-生物素對激活的細胞毒性T淋巴細胞進行表面蛋白共價結合法生物素化,并分析至72小時時的標記效率及T淋巴細胞存活率。通過慢病毒轉染的方法對膠質瘤干細胞進行細胞表面生物素化,并生物熒光素酶轉染觀察熒光素酶分泌情況。將生物素化的膠質瘤干細胞同激活的T淋巴細胞體外共培養(yǎng)24小時,觀察殺傷效果。統(tǒng)計學采用Student's t-test, P0.05視為有統(tǒng)計學差異。結果：慢病毒轉染法生物素化細胞毒性T淋巴細胞效率較低(15.50±3.027%),且細胞損傷嚴重。而共價結合細胞表面生物素化的方法可以對激活的T淋巴細胞高效標記(98.36±0.6129%)。體外通過流式分析術可以敏銳檢測到標記以鏈酶親和素熒光探針的激活的T淋巴細胞,且檢測到生物素化的T淋巴細胞72小時以內活性不受影響并細胞標記不丟失。膠質瘤干細胞可以被慢病毒成功轉染,細胞表面表達生物素效率較高,且細胞存活良好。體外T淋巴細胞同腫瘤細胞共培養(yǎng)結果表明以鏈酶親和素為橋梁的靶向組T淋巴細胞殺傷腫瘤效果最好,腫瘤形態(tài)發(fā)生明顯改變,腫瘤表達熒光量降低,且可見標記以熒光探針的T淋巴細胞聚集于腫瘤群落周圍。利用生物熒光素酶檢測膠質瘤干細胞的生長分泌情況發(fā)現,相對于對照組及非靶向組,靶向組腫瘤生長受到明顯抑制(對照組P0.001；非靶向組P0.01)結論：本研究中利用共價結合表面生物素化并鏈酶親和素熒光復合物成功實現了細胞毒性T淋巴細胞靶向生物素化膠質瘤的體外熒光示蹤。鏈酶親和素增強細胞毒性T淋巴細胞對生物素化膠質瘤干細胞的靶向及殺傷作用。展望：實現MRI同熒光成像結合的雙模態(tài)成像。為實現細胞毒性T淋巴細胞免疫治療膠質瘤中細胞示蹤并復雜腫瘤免疫微環(huán)境的監(jiān)測,可通過細胞表面熒光標記實現細胞毒性T淋巴細胞體內熒光示蹤；結合MPO-Gd增強圖像來評價T淋巴細胞免疫治療后膠質瘤周圍炎性免疫微環(huán)境的變化,綜合評價免疫治療的療效并進行機制研究。總之,本研究中,我們合成了MPO特異性磁共振智能探針和熒光智能探針；通過MPO可激活的智能探針,將MPO作為一個敏感的成像靶點對中樞及外周的活動性炎性病灶成像可行；通過T淋巴細胞表面生物素化,借助鏈酶親和素熒光復合物實現T淋巴細胞靶向生物素化膠質瘤干細胞的體外熒光示蹤并監(jiān)測殺傷效果；為多模態(tài)成像評估復雜生物分子事件奠定基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R741;R445.2

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