發(fā)布時(shí)間：2018-03-24 14:21

  本文選題：DNMT1　切入點(diǎn)：miRNA-20a　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)惡性腫瘤,具有侵襲性強(qiáng)、惡性進(jìn)展快、極易復(fù)發(fā)、預(yù)后差等特點(diǎn)。雖然以手術(shù)為主、結(jié)合放療和化療為輔的綜合治療方法使膠質(zhì)瘤患者的生存期有所延長,但其總體的治療效果仍然欠佳�；熢趷盒阅z質(zhì)瘤臨床治療中的作用越來越被重視,而替莫唑胺是目前我們臨床治療神經(jīng)肢質(zhì)瘤的一線化療藥物,但替莫唑胺耐藥成為膠質(zhì)瘤化療失敗的主要原因。肢質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺耐藥的機(jī)制尚不完全清楚,尋找預(yù)防和治療膠質(zhì)瘤細(xì)胞替莫唑胺耐藥的新型靶標(biāo),對(duì)進(jìn)一步提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療水平具有重大意義。近年來隨著微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)研究的持續(xù)深入進(jìn)行,發(fā)現(xiàn)miRNAs在各類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中經(jīng)常扮演著非常重要的角色,根據(jù)不同的靶向基因可能擁有與類似癌基因或抑癌基因的作用,且在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療耐藥中也發(fā)揮著重要作用。miRNAs是一類大小約19-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,普遍存在于真核生物細(xì)胞中。大部分miRNA主要通過與靶基因mRNA3'末端非翻譯區(qū)(3' UTR)完全或不完全互補(bǔ)的特異性結(jié)合使其降解,偶爾也與靶基因mRNA 5'末端非翻譯區(qū)(5' UTR)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制靶基因翻譯,從而實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的負(fù)性調(diào)控。miR-20a是miR-17-92基因簇的一員,該基因簇共包含7個(gè)miRNAs:miR-17-3p、miR-17-5p、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a 和 miR-92a-16。目前的研究顯示miR-20能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖、侵襲遷移,抑制細(xì)胞凋亡,在肢質(zhì)瘤中發(fā)揮著癌基因的作用。本課題前期實(shí)驗(yàn)研究證明miR-20a在肢質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)且負(fù)向調(diào)控靶基因LRIG1,與促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞替莫唑胺耐藥相關(guān);LRIG1可負(fù)性調(diào)節(jié)EGFR信號(hào)通路而發(fā)揮抑癌基因作用,增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化能夠調(diào)控約50%miRNAs的表達(dá),而這其中又有約近半數(shù)的miRNAs在大量人類惡性腫瘤中存在異常的甲基化修飾。miRNAs啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化程度的改變可以影響miRNA表達(dá)和下游目標(biāo)mRNAs的調(diào)節(jié)。甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)介導(dǎo)的DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控的一個(gè)主要手段。DNA甲基化是在DNMTs(DNMT1,DNMT3a和DNMT3b等)催化下以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基的供體,將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到CpG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上,使得5C位點(diǎn)上的氫被活性甲基基團(tuán)取代而轉(zhuǎn)變成5-mC(5-甲基胞嘧啶)的化學(xué)修飾過程。目前研究發(fā)現(xiàn)DNMTs與多種癌癥化療耐藥相關(guān),但DNMTs參與膠質(zhì)瘤耐藥的機(jī)制尚未清楚且研究較少。綜上所述,本課題旨在通過對(duì)DNMT1表達(dá)與miR-20a啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平的研究,從而發(fā)現(xiàn)DNA甲基化異常與miR-20a表達(dá)之間的關(guān)系,研究DNMT1調(diào)節(jié)miR-20a表達(dá)及對(duì)其靶基因LRIG1和其下游信號(hào)通路的影響,進(jìn)而明確DNMT1和miR-20a參與膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥的潛在機(jī)制。本課題研究結(jié)果有望為克服神經(jīng)肢質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥提供新的有效方法。目的研究DNMT1通過miR-20a調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞替莫唑胺耐藥性的分子機(jī)制。方法采用替莫唑胺長期濃度梯度遞增法建立人腦膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥模型細(xì)胞株(U251/TMZ),并檢測耐藥細(xì)胞株的相關(guān)耐藥基因表達(dá)水平確定耐藥性。在體外實(shí)驗(yàn)?zāi)z質(zhì)瘤細(xì)胞(U251)水平和在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物(裸鼠)水平分別研究驗(yàn)證DNMT1通過調(diào)節(jié)miR-20a表達(dá)對(duì)其靶基因LRIG1和其下游信號(hào)通路的影響而參與肢質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥的機(jī)制。結(jié)果(1)人腦膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥細(xì)胞株(U251/TMZ)成功建立,具有穩(wěn)定的耐藥性。(2)U251/TMZ細(xì)胞株中DNMT1的表達(dá)水平明顯低于正常U251細(xì)胞株,而miR-20a表達(dá)水平明顯高于正常U251細(xì)胞株。(3)DNMT1通過調(diào)節(jié)miRNA-20a基因啟動(dòng)子甲基化水平來調(diào)節(jié)miR-20a和LRIG1的表達(dá)。(4)miR-20a-LRIG1軸是DNMT1參與肢質(zhì)瘤細(xì)胞替莫唑胺耐藥的下游信號(hào)靶點(diǎn)。(5)DNMT1-miR-20a-LRIG1 軸調(diào)控 EGFR/AKT/mTOR信號(hào)通路活性。結(jié)論:在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證明DNMT1通過調(diào)節(jié)miRNA-20a基因啟動(dòng)子甲基化水平來調(diào)節(jié)miR-20a表達(dá),繼而調(diào)控LRIG1的表達(dá),并且通過miR-20a/LRIG1調(diào)控下游EGFR/AKT/mTOR信號(hào)通路參與肢質(zhì)瘤細(xì)胞替莫唑胺耐藥的調(diào)節(jié)機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1658676