本文選題：USP22　切入點(diǎn)：膠質(zhì)瘤　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：以成人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)為主要代表的惡性膠質(zhì)瘤被認(rèn)為是顱腦腫瘤中最常見的一種腫瘤類型。盡管近些年來(lái)對(duì)惡性膠質(zhì)瘤采取了以手術(shù)為主,輔以放化療的綜合治療策略,但是對(duì)患者的中位生存期并沒有多大的延長(zhǎng),僅為14個(gè)月左右。惡性膠質(zhì)瘤通常具有快速增殖、遷移、侵襲、易復(fù)發(fā)以及對(duì)放療抵抗和化療耐藥等特點(diǎn)。針對(duì)惡性膠質(zhì)瘤難治易復(fù)發(fā)的主要原因,目前腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)被大部分人所接受。即人們發(fā)現(xiàn)在惡性膠質(zhì)瘤實(shí)體內(nèi)部,存在著一小部分側(cè)群細(xì)胞,被稱為是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSC),它們具有和神經(jīng)干細(xì)胞相似的特點(diǎn),比如能形成神經(jīng)球,能進(jìn)行自我更新以及能被誘導(dǎo)分化。常規(guī)的手術(shù)切除以及放化療只能做到“治標(biāo)”,即去除和消滅已分化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞,而對(duì)于具有放化療抗性的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞側(cè)群則缺乏明顯的殺傷效果,因此這些干細(xì)胞可以繼續(xù)進(jìn)行不對(duì)稱自我復(fù)制,引起腫瘤的復(fù)發(fā)。因此針對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究對(duì)改善惡性膠質(zhì)瘤的治療現(xiàn)狀具有重大的意義。近些年來(lái),對(duì)膠質(zhì)瘤干性的相關(guān)分子研究當(dāng)中,多梳基因(polycomb genes)一直是熱點(diǎn)所在。這些基因又能形成兩個(gè)復(fù)合物,即以Bmi1為代表的多梳抑制復(fù)合物1(PRC1)和以Ezh2為主的多梳抑制復(fù)合物2(PRC2)。這些基因平時(shí)通過(guò)表觀遺傳修飾作用調(diào)控著眾多下游基因的轉(zhuǎn)錄。正常情況下,干細(xì)胞的自我更新復(fù)制和分化過(guò)程是受到體內(nèi)嚴(yán)格的控制的。多梳基因的的異常表達(dá)往往會(huì)引起抑癌基因的轉(zhuǎn)錄失常并引起某些干性相關(guān)信號(hào)通路的異常激活,促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的形成和腫瘤的發(fā)展。值得注意的是,2005年由Glinsky帶領(lǐng)的實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由11個(gè)基因所組成的“death-from-cancer”的基因譜,這些基因被認(rèn)為腫瘤的干性密切相關(guān),對(duì)人類常見的絕大多數(shù)惡性腫瘤的侵襲,轉(zhuǎn)移以及預(yù)后都具有重要的預(yù)測(cè)價(jià)值。而這其中就有多梳基因Bmi1和最近才被定義為腫瘤干性相關(guān)分子的去泛素化酶USP22。作為去泛素化酶(Dub)家族中最大的去泛素化特異蛋白水解酶(USP)亞族的成員之一,USP22對(duì)細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及免疫環(huán)境都起著重要的調(diào)節(jié)作用。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制上,USP22能參與基因的表觀遺傳修飾。一方面USP22屬于SAGA轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的成員,能參與靶基因的去乙酰化轉(zhuǎn)錄調(diào)控。另一方面,USP22可以直接使組蛋白u(yù)b H2A和ub H2B去泛素化,從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在翻譯后修飾的調(diào)控上,USP22可以水解目標(biāo)蛋白的泛素化標(biāo)簽,避免其蛋白水解,提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的底物蛋白有SIRT1、TBP1,FUBP1和RCAN1等。研究發(fā)現(xiàn),USP22在許多惡性腫瘤中都處于高表達(dá),如胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等,并能促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移,抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn),USP22在不同的腫瘤中能參與多個(gè)促癌信號(hào)通路的調(diào)控,如JAK-STAT信號(hào)通路,雄激素受體(AR)信號(hào)通路,局部黏附激酶(FAK)信號(hào)通路以及由Bmi1介導(dǎo)的INK4a/ARF和AKT信號(hào)通路。目前已有個(gè)別報(bào)道表明相比于正常腦組織,USP22在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)更高,且蛋白表達(dá)水平與腫瘤的級(jí)別呈正相關(guān)以及和患者的存活時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,敲減USP22能導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂G1/S期的阻滯以及促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,但是除了影響細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡外,USP22能否影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的其他惡性生物學(xué)行為,如增殖、遷移和侵襲目前尚不清楚。尤其是作為腫瘤干性相關(guān)標(biāo)記物,USP22能否影響膠質(zhì)瘤的干性更值得去研究。而作為去泛素化酶,USP22的促癌作用無(wú)疑與其對(duì)下游一系列底物癌蛋白的穩(wěn)定密切相關(guān)。因此,USP22對(duì)于腫瘤干性的維持很大程度上也與其對(duì)干性基因相關(guān)蛋白的穩(wěn)定有關(guān)。而作為“death-from-cancer”的基因譜的主導(dǎo)成員,Bmi1對(duì)許多基因都能起到表觀遺傳修飾的作用,從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。在膠質(zhì)瘤中,已經(jīng)有研究證明Bmi1處于高表達(dá)水平,它不僅能促進(jìn)已分化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,降低放化療敏感性,而且更重要的是它還能維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的存活和自我更新復(fù)制,抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的凋亡和避免免疫系統(tǒng)的攻擊。而敲除Bmi1能顯著降低惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆形成以及致瘤能力。因此降低惡性膠質(zhì)瘤中Bmi1的水平,對(duì)消滅膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有重大的意義。而已有相關(guān)研究表明,Bmi1在體內(nèi)是一種半衰期較短的小分子蛋白,其翻譯后水平受到由E3泛素連接酶介導(dǎo)的蛋白降解途徑的調(diào)控。已有研究發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶β-Trcp以及Spop均能使Bmi1泛素化從而影響其表達(dá)水平。鑒于在體內(nèi),泛素化和去泛素化是兩個(gè)相互拮抗的過(guò)程,因此Bmi1在腫瘤中蛋白水平的高表達(dá)很大程度上依賴于去泛素化酶的穩(wěn)定作用,因此探尋在惡性膠質(zhì)瘤中穩(wěn)定Bmi1的去泛素化酶就至關(guān)重要。已有研究發(fā)現(xiàn)在不少惡性腫瘤中去泛素化酶USP22與Bmi1經(jīng)常共同處于高表達(dá)狀態(tài),尤其在胃癌中還發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)水平呈正相關(guān),在結(jié)腸癌以及非小細(xì)胞肺癌中也有USP22調(diào)控Bmi1表達(dá)的報(bào)道,進(jìn)一步提示兩者之間的緊密關(guān)系。通過(guò)查閱Human protein atlas數(shù)據(jù)庫(kù),我們同樣發(fā)現(xiàn)USP22與Bmi1在惡性膠質(zhì)瘤中也處于共同高表達(dá)。鑒于目前在膠質(zhì)瘤中,Bmi1高表達(dá)水平機(jī)制并不明確。我們基于上述種種事實(shí),提出了我們的假設(shè),即在膠質(zhì)瘤中Bmi1的高表達(dá)可能是由USP22的去泛素化穩(wěn)定機(jī)制介導(dǎo)的,而USP22對(duì)于膠質(zhì)瘤干性的影響也與其對(duì)Bmi1的穩(wěn)定密切相關(guān)。本文章中可分為五個(gè)部分。第一部分我們通過(guò)30例來(lái)自我院的不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤標(biāo)本(WHO II級(jí)和WHO IV級(jí)各15例)中對(duì)USP22的免疫組化以及結(jié)合Human protein atlas數(shù)據(jù)庫(kù)分析,再次驗(yàn)證了在USP22的蛋白表達(dá)在正常腦組織中、低級(jí)別膠質(zhì)瘤以及高級(jí)別膠質(zhì)瘤中逐漸升高,生存分析發(fā)現(xiàn)USP22高表達(dá)提示膠質(zhì)瘤預(yù)后不良。第二部分我們以U251惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞為研究對(duì)象,對(duì)USP22的生物學(xué)功能進(jìn)行了相關(guān)的研究,在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)敲減USP22能減慢U251細(xì)胞的增殖,遷移以及侵襲能力。鑒于USP22被認(rèn)為與腫瘤干性相關(guān),因此第三部分我們以在干細(xì)胞培養(yǎng)液中對(duì)U251、U87以及GBM-HSF三種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)干培養(yǎng),以成球能力作為判斷腫瘤干性的指標(biāo),著重對(duì)USP22是否能影響膠質(zhì)瘤腫瘤干性進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)敲除USP22以后,上述三種膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的成球能力均有減弱。利用熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)在貼壁和成球兩種條件下膠質(zhì)瘤細(xì)胞中干性基因的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)USP22的敲除會(huì)引起多個(gè)干性基因的轉(zhuǎn)錄水平降低。利用western blot蛋白印跡法檢測(cè)在貼壁和成球兩種培養(yǎng)條件下USP22的表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)在U251細(xì)胞中,成球狀態(tài)下USP22的表達(dá)量明顯高于貼壁狀態(tài)下的表達(dá)。第四部分我們對(duì)USP22影響膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為尤其是腫瘤干性的機(jī)制進(jìn)行了研究。為了驗(yàn)證我們前面的推斷,我們著重針對(duì)USP22與Bmi1之間的表達(dá)以及調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了探索。首先通過(guò)對(duì)30例不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織切片進(jìn)行免疫組化,我們發(fā)現(xiàn)USP22與Bmi1共定位在細(xì)胞核,與低級(jí)別膠質(zhì)瘤中相比兩者的表達(dá)在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中更高,且在同一個(gè)腫瘤組織中兩者的表達(dá)水平呈現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)性。在HEK293FT和U251細(xì)胞中進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),發(fā)現(xiàn)USP22與Bmi1在細(xì)胞核中分布具有很強(qiáng)的重疊性,且通過(guò)免疫熒光強(qiáng)度也可以看出兩者的表達(dá)水平呈現(xiàn)一定程度的正相關(guān)。接著我們?cè)俅悟?yàn)證了Bmi1的蛋白水平受泛素化途徑調(diào)控。通過(guò)免疫共沉淀和免疫印跡的方法發(fā)現(xiàn)在HEK293FT細(xì)胞中外源性過(guò)表達(dá)的USP22能與Bmi1直接結(jié)合相互作用,從而穩(wěn)定Bmi1的蛋白水平,并且這是以來(lái)USP22的去泛素化酶活性的。而在內(nèi)源性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,敲除USP22后,Bmi1的轉(zhuǎn)錄水平有所升高,而蛋白水平卻呈現(xiàn)下降趨勢(shì),也間接說(shuō)明了USP22在蛋白水平上對(duì)Bmi1起到了穩(wěn)定的作用。而敲減Bmi1的表達(dá)后,USP22的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升,說(shuō)明Bmi1可能參與USP22的轉(zhuǎn)錄抑制。最后鑒于PRC復(fù)合物對(duì)腫瘤干性影響的普遍性和重要性以及Bmi1是PRC1復(fù)合物的成員分子,我們同時(shí)對(duì)PRC2復(fù)合物的一些成員進(jìn)行了免疫印跡蛋白水平的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在U251細(xì)胞中,內(nèi)源性USP22敲減后PRC2復(fù)合物相關(guān)成員Ezh2,Suz12與H3K27me3的表達(dá)均無(wú)明顯變化。第五部分對(duì)USP22和Bmi1影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性的具體下游分子機(jī)制進(jìn)行了初步探究,通過(guò)相關(guān)基因芯片分析并挑選基因進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn),USP22和Bmi1能共同調(diào)控許多下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,這些靶基因很多都與細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)內(nèi)分泌以及細(xì)胞發(fā)育有關(guān)。第一部分USP22在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和預(yù)后研究目的:再次通過(guò)我院的臨床膠質(zhì)瘤標(biāo)本結(jié)合權(quán)威腫瘤分子生物學(xué)信息庫(kù)數(shù)據(jù)驗(yàn)證USP22在膠質(zhì)瘤中的高表達(dá)水平,并研究USP22水平對(duì)患者生存期的影響,突出USP22在膠質(zhì)瘤中的致癌性。方法:通過(guò)在長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)外科收集的30例不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織石蠟切片(WHO II級(jí)和WHO IV級(jí)各15例)以及5例正常腦組織中對(duì)USP22進(jìn)行免疫組化染色,比較高級(jí)別膠質(zhì)瘤、低級(jí)別膠質(zhì)瘤以及正常腦組織中USP22的表達(dá)水平差異。通過(guò)在Human protein atlas權(quán)威腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.proteinatlas.org/)中查詢USP22的相關(guān)蛋白表達(dá)信息來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)的可靠性。結(jié)合隨訪資料對(duì)患者總生存期進(jìn)行生存分析,明確USP22與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:通過(guò)30例不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤以及5例正常腦組織中對(duì)USP22的免疫組化的結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)USP22的蛋白表達(dá)在正常腦組織中、低級(jí)別膠質(zhì)瘤以及高級(jí)別膠質(zhì)瘤中逐漸升高,這與Human protein atlas上的結(jié)果一致。USP22高表達(dá)提示患者的預(yù)后不良。結(jié)論:USP22在膠質(zhì)瘤中高表達(dá),且隨著腫瘤惡性程度增高而表達(dá)增高,其高表達(dá)提示患者的預(yù)后不良,提示USP22與膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。第二部分USP22對(duì)惡性膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響目的:研究USP22對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的影響。方法:我們分別構(gòu)建了兩條USP22sh RNA慢病毒感染U251細(xì)胞株。并利用western blot蛋白印跡法驗(yàn)證了這兩條sh RNA的有效性。隨后我們利用WST-1法檢測(cè)U251細(xì)胞的增殖能力并繪制了增殖曲線,分別在24h、48h以及72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)和陰性對(duì)照組做了增殖能力的比較。利用Wound healing劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了U251細(xì)胞的遷移能力,并分別在18h和36h和陰性對(duì)照組做了遷移能力的比較。利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了U251的侵襲能力,并在72h和陰性對(duì)照組做了侵襲能力的比較。結(jié)果:在U251細(xì)胞中當(dāng)USP22表達(dá)被抑制后,在第一個(gè)24h內(nèi)三組細(xì)胞的增殖速度無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但是隨著時(shí)間的推移,在48h和72h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)USP22sh RNA慢病毒感染組U251的細(xì)胞增殖速度明顯減慢,和陰性對(duì)照組之間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.001)。當(dāng)USP22被敲除后,我們?cè)趧澗�后18h和36h分別對(duì)兩組細(xì)胞的遷移距離進(jìn)行了測(cè)量,發(fā)現(xiàn)USP22sh RNA慢病毒感染的U251細(xì)胞的遷移速度在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上與陰性對(duì)照細(xì)胞相比均有明顯的減慢,且差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001)。利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了U251的侵襲能力,并在72h和陰性對(duì)照組做了侵襲能力的比較,發(fā)現(xiàn)USP22sh RNA慢病毒感染的U251細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱,且差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001)。結(jié)論:USP22對(duì)維持U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為有重要的作用。第三部分USP22對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性的影響目的:以成球能力作為腫瘤干性能力的指標(biāo),探究USP22在不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中對(duì)腫瘤干性的影響。方法:我們?cè)赨251和U87細(xì)胞中,構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)慢病毒USP22sh RNA的細(xì)胞系,在GBM-HSF細(xì)胞中構(gòu)建了可調(diào)控的USP22sh RNA表達(dá)系統(tǒng),并利用熒光定量PCR和western blot蛋白印跡技術(shù)對(duì)sh RNA的干擾效率以及可誘導(dǎo)USP22sh RNA表達(dá)系統(tǒng)的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證。在無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)液中,對(duì)U251、U87和GBM-HSF細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞成球培養(yǎng),通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析研究USP22對(duì)三種細(xì)胞系干細(xì)胞成球的影響。利用熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)在貼壁和成球兩種條件下膠質(zhì)瘤細(xì)胞中干性基因的表達(dá)變化。利用western blot蛋白印跡法檢測(cè)在貼壁和成球兩種培養(yǎng)條件下USP22的表達(dá)差異。結(jié)果:在U251和U87細(xì)胞中USP22sh RNA的效率理想,在GBM-HSF細(xì)胞中,經(jīng)過(guò)強(qiáng)力霉素Dox處理后,USP22的m RNA水平下降了約75%,蛋白表達(dá)水品也明顯減少。在無(wú)血清的干細(xì)胞培養(yǎng)液中將貼壁的U251、U87和GBM-HSF轉(zhuǎn)干培養(yǎng)后,三種細(xì)胞均具有成球的能力。在這三種細(xì)胞系中,USP22的表達(dá)抑制均導(dǎo)致了細(xì)胞成球直徑的減小,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.001)。我們?cè)谫N壁的U251細(xì)胞以及成球的GBM-HSF細(xì)胞中進(jìn)行了相關(guān)干性基因的檢測(cè),均發(fā)現(xiàn)USP22的內(nèi)源性表達(dá)抑制會(huì)引起部分干性基因的轉(zhuǎn)錄水平的下降。通過(guò)western blot免疫印跡法在轉(zhuǎn)干前后兩種狀態(tài)下的U251中進(jìn)行了USP22蛋白水平的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞培養(yǎng)條件下,USP22的蛋白水平較在分化培養(yǎng)條件下要明顯增高。結(jié)論:1.USP22是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物之一,在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中有更高的表達(dá)。2.USP22對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的干性起著重要的維持作用,具體機(jī)制和影響干性基因的轉(zhuǎn)錄水平有一定的關(guān)系。第四部分USP22影響膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為的機(jī)制研究目的:研究USP22影響膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為的機(jī)制并重點(diǎn)探索USP22與Bmi1之間的表達(dá)以及調(diào)控關(guān)系。方法:通過(guò)在長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)外科收集的30例不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織石蠟切片(WHO II級(jí)和WHO IV級(jí)各15例)中分別對(duì)USP22和Bmi1進(jìn)行免疫組化染色,并根據(jù)染色深度以及染色面積等指標(biāo)計(jì)算出總的表達(dá)強(qiáng)度。通過(guò)Graphpad Prism軟件來(lái)分析計(jì)算在同一個(gè)腫瘤組織中兩者之間在表達(dá)上的相關(guān)性。在HEK293FT細(xì)胞中同時(shí)過(guò)表達(dá)外源性USP22與Bmi1,并利用免疫熒光染色來(lái)觀察USP22與Bmi1在亞細(xì)胞定位分布以及表達(dá)上的關(guān)系;在U251細(xì)胞中,利用免疫熒光染色來(lái)觀察內(nèi)源性USP22與Bmi1在亞細(xì)胞定位以及表達(dá)水平上的關(guān)系。在HEK293FT細(xì)胞中過(guò)表達(dá)了外源性GFP-Bmi1質(zhì)粒,用western蛋白印跡法檢測(cè)經(jīng)蛋白酶體抑制劑處理后,外源性Bmi1的蛋白水平變化。在HEK293FT細(xì)胞中分別同時(shí)外源性共轉(zhuǎn)染Bmi1和USP22野生型/酶活性突變型,用western蛋白印跡法檢測(cè)外源性USP22對(duì)Bmi1的蛋白水平的影響。在敲減USP22的U251細(xì)胞中,運(yùn)用熒光定量PCR和免疫印跡的方法分別檢測(cè)Bmi1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平。運(yùn)用免疫共沉淀的方法在HEK293FT細(xì)胞中檢測(cè)USP22與Bmi1的直接相互作用。在U251細(xì)胞中,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Bmi1對(duì)USP22的轉(zhuǎn)錄水平的影響。最后鑒于PRC復(fù)合物對(duì)腫瘤干性影響的普遍性和重要性以及Bmi1是PRC1復(fù)合物的成員分子,我們同時(shí)對(duì)PRC2復(fù)合物的一些成員進(jìn)行了免疫印跡蛋白水平的檢測(cè)。結(jié)果:通過(guò)30例子不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤中對(duì)USP22與Bmi1的免疫組化的結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)相較于低級(jí)別膠質(zhì)瘤,在高級(jí)別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)更高,且在同一個(gè)腫瘤組織中兩者的表達(dá)水平具有較強(qiáng)的正相關(guān)性。我們通過(guò)在HEK293FT細(xì)胞中同時(shí)過(guò)表達(dá)外源性USP22與Bmi1以及在U251細(xì)胞中,利用免疫熒光染色來(lái)分別觀察外源性和內(nèi)源性USP22與Bmi1在亞細(xì)胞定位分布以及表達(dá)水平上的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)USP22與Bmi1在細(xì)胞核中分布具有很強(qiáng)的重疊性,且通過(guò)免疫熒光強(qiáng)度也可以看出兩者的表達(dá)水平呈現(xiàn)一定程度的正相關(guān)。在HEK293FT細(xì)胞中驗(yàn)證了Bmi1的蛋白水平受泛素化水平的影響。并發(fā)現(xiàn)外源性過(guò)表達(dá)野生型的Flag-USP22能增加GFP-Bmi1的表達(dá),而過(guò)表達(dá)Flag-USP22C185S酶活性突變體不影響B(tài)mi1的蛋白水平。在U251細(xì)胞中,USP22的內(nèi)源性表達(dá)抑制會(huì)引起內(nèi)源性Bmi1的轉(zhuǎn)錄水平的明顯上升,而Bmi1的蛋白水平卻有不同程度的下降趨勢(shì),尤以慢病毒干擾效率較強(qiáng)的USP22sh RNA1組明顯。在HEK293FT細(xì)胞中通過(guò)免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)外源性過(guò)表達(dá)野生型的Flag-USP22可以與外源性GFP-Bmi1直接相互作用,而過(guò)表達(dá)Flag-USP22C185S酶活性突變體不能直接結(jié)合GFP-Bmi1。在U251細(xì)胞中利用慢病毒干擾抑制Bmi1的內(nèi)源性表達(dá)受后,發(fā)現(xiàn)USP22的轉(zhuǎn)錄水平有明顯的上升。最后免疫印跡法發(fā)現(xiàn)在U251細(xì)胞中,內(nèi)源性USP22敲減后PRC2復(fù)合物相關(guān)成員Ezh2,Suz2與H3K27me3的表達(dá)均無(wú)明顯變化。結(jié)論:1.USP22與Bmi1共同定位于細(xì)胞核,且在亞細(xì)胞定位層面的分布擬合度高。2.與低級(jí)別膠質(zhì)瘤相比較,USP22與Bmi1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)水平明顯升高。不僅在膠質(zhì)瘤臨床組織中,而且在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,USP22與Bmi1的表達(dá)水平存在一定的正相關(guān)性。3.Bmi1的蛋白穩(wěn)定性確實(shí)受到泛素化水平的調(diào)控。4.在無(wú)轉(zhuǎn)錄影響的干擾下,USP22能穩(wěn)定Bmi1的蛋白水平,且這種穩(wěn)定作用是通過(guò)兩者的直接作用而實(shí)現(xiàn)的,與USP22的去泛素化酶活性位點(diǎn)緊密相關(guān)。5.在U251細(xì)胞中,內(nèi)源性的USP22一方面能抑制Bmi1的轉(zhuǎn)錄水平,另一方面又能維持Bmi1蛋白穩(wěn)定性。6.在U251細(xì)胞中USP22與Bmi1表達(dá)的正相關(guān)性無(wú)法用Bmi1對(duì)USP22的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來(lái)解釋。7.在U251細(xì)胞中,PRC2復(fù)合物不參與USP22對(duì)膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)。第五部分USP22和Bmi1共同影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性的分子機(jī)制的初步探討目的:研究受USP22與Bmi1共同影響的基因譜與膠質(zhì)瘤干性的關(guān)系。方法:在感染USP22sh RNA1、Bmi1sh RNA以及陰性對(duì)照的U251細(xì)胞中用Agilent表達(dá)譜基因芯片來(lái)分析并找出共同受USP22和Bmi1影響的基因,分析這些基因所富集的相關(guān)信號(hào)通路。在以上這些基因中,通過(guò)查找Pubmed文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)并用Excel軟件進(jìn)一步篩選出在膠質(zhì)瘤中有較明確的生物學(xué)功能的基因,并隨機(jī)挑選了8個(gè)基因用實(shí)時(shí)熒光定量RCR法驗(yàn)證芯片結(jié)果。結(jié)果:與陰性對(duì)照組相比,USP22與Bmi1的內(nèi)源性表達(dá)抑制后,各自有2151和1488個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了2倍以上的改變,且其中有413個(gè)基因是受兩者共同影響的。通過(guò)相關(guān)富集和信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)這413個(gè)基因主要與細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫調(diào)節(jié)以及細(xì)胞分化等信號(hào)通路有關(guān)。我們對(duì)膠質(zhì)瘤中有較明確的生物學(xué)功能的基因進(jìn)行了遴選,發(fā)現(xiàn)這些基因參與的生物學(xué)功能基本與上述的幾個(gè)通路是相符合的。在這些基因中,我們隨機(jī)選擇了8個(gè)基因,發(fā)現(xiàn)這些基因中大部分都與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的干性維持有關(guān)。芯片分析結(jié)果顯示這8個(gè)基因在USP22和Bmi1表達(dá)水平受到干擾后,轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的下降,并用熒光定量PCR對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)與芯片結(jié)果是一致的。結(jié)論:1.在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,USP22與Bmi1各自都直接或間接地影響著許多基因的表達(dá),而其中有不少比例的基因受到兩者的共同影響,也從一個(gè)側(cè)面驗(yàn)證了USP22與Bmi1在轉(zhuǎn)錄調(diào)控上的高相關(guān)性。2.受USP22與Bmi1共同影響的基因中,大部分與細(xì)胞外基質(zhì),神經(jīng)內(nèi)分泌,免疫以及細(xì)胞分化等相關(guān)通路有關(guān)。3.通過(guò)對(duì)芯片結(jié)果驗(yàn)證,USP22與Bmi1對(duì)許多干性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平有維持作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 程迎新;唐文淵;;惡性膠質(zhì)瘤患者外周血淋巴細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2006年16期

2 Steinbach J.P;Blaicher H.-P;Herrlinger U;郭俊;;存活5年以上惡性膠質(zhì)瘤患者的狀況[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(神經(jīng)病學(xué)分冊(cè));2006年11期

3 陳海燕;白永瑞;;惡性膠質(zhì)瘤的綜合治療現(xiàn)狀[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2010年08期

4 章翔;放療導(dǎo)致顱內(nèi)惡性膠質(zhì)瘤[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊(cè);1990年02期

5 趙德明;放射導(dǎo)致顱內(nèi)惡性膠質(zhì)瘤[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)分冊(cè));1990年03期

6 浦佩玉;惡性膠質(zhì)瘤的治療進(jìn)展[J];醫(yī)師進(jìn)修雜志;1995年11期

7 楊海城,蘇君,張學(xué)新,肖宏;幕上惡性膠質(zhì)瘤腦脊液播散2例[J];黑龍江醫(yī)學(xué);2001年08期

8 許茂盛,李來(lái)友,陳星榮,喻迎星,馮曉源,沈天真;惡性膠質(zhì)瘤的二維氫質(zhì)子磁共振波譜研究[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)計(jì)算機(jī)成像雜志;2002年05期

9 陳志剛,盧亦成,丁學(xué)華,朱誠(chéng);惡性膠質(zhì)瘤化療新進(jìn)展[J];中華神經(jīng)外科雜志;2003年01期

10 姜新雅,仇斌,李文政,王維;顱內(nèi)惡性膠質(zhì)瘤術(shù)后腦組織正常反應(yīng)與術(shù)后殘存的動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI鑒別[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù);2004年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 徐國(guó)政;杜浩;宋健;高寶成;黃河;文雪;;影響惡性膠質(zhì)瘤預(yù)后的多因素分析[A];中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)外科醫(yī)師分會(huì)第六屆全國(guó)代表大會(huì)論文匯編[C];2011年

2 楊學(xué)軍;曾崢;孫健;;惡性膠質(zhì)瘤規(guī)范化治療中關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的個(gè)體化決策[A];2011中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

3 歐陽(yáng)輝;漆松濤;李志勇;張輝;;用現(xiàn)代觀點(diǎn)方法積極開展復(fù)發(fā)惡性膠質(zhì)瘤的治療[A];2011中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

4 王j;高國(guó)棟;;體外化療藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果與惡性膠質(zhì)瘤化療方案的選擇[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

5 薛偉明;王占祥;譚國(guó)偉;馬永會(huì);姜月明;朱宏偉;葉永造;;惡性膠質(zhì)瘤45例術(shù)后放、化療臨床分析[A];2011中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

6 楊學(xué)軍;董雪濤;王華民;王維;李瑜;張斌;于圣平;;膠質(zhì)瘤中hMena蛋白表達(dá)與惡性膠質(zhì)瘤侵襲方式的研究[A];2011中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

7 李安民;傅相平;張志文;梁樹立;易林華;;單克隆抗體標(biāo)載的~(131)I治療惡性膠質(zhì)瘤三種給藥方法的比較[A];中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)外科醫(yī)師分會(huì)首屆全國(guó)代表大會(huì)論文匯編[C];2005年

8 臧國(guó)堯;王義榮;朱先理;孫偉軍;楊樹旭;李新偉;牛煥江;方兵;;惡性膠質(zhì)瘤輔助化療23臨床分析[A];2005年浙江省神經(jīng)外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

9 臧國(guó)堯;王義榮;朱先理;孫偉軍;楊樹旭;李新偉;牛煥江;方兵;;輔助化療在惡性膠質(zhì)瘤綜合治療中價(jià)值[A];2006年浙江省神經(jīng)外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

10 楊學(xué)軍;孫健;曾崢;王毅;董雪濤;張斌;任炳成;;中央前回深部惡性膠質(zhì)瘤的手術(shù)策略(手術(shù)全程錄像演示)[A];2011中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 丁香;藥物研發(fā)推進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤化療進(jìn)展[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前7條

1 仇冠中;去泛素化酶USP22對(duì)惡性膠質(zhì)瘤增殖、遷移、侵襲和干性的影響以及機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

2 程迎新;惡性膠質(zhì)瘤相關(guān)基因表達(dá)變化的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2006年

3 徐國(guó)政;惡性膠質(zhì)瘤的臨床與抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體的體外抗瘤效應(yīng)研究[D];武漢大學(xué);2010年

4 李鵬;惡性膠質(zhì)瘤補(bǔ)救性化療的臨床與實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2014年

5 趙紅宇;基質(zhì)金屬蛋白酶-2和-9對(duì)惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞侵襲作用的影響[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2009年

6 陳秋鈴;Nodosin對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的作用及其機(jī)制研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2013年

7 范海濤;惡性膠質(zhì)瘤及顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的基因與免疫治療[D];山東大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 鄭麗云;蛋白激酶B(Akt)抑制劑哌立福新抗人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2015年

2 李震;惡性膠質(zhì)瘤病人長(zhǎng)期生存的原因分析[D];大連醫(yī)科大學(xué);2013年

3 錢曉波;手術(shù)聯(lián)合~（32）P間質(zhì)內(nèi)放療治療復(fù)發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤的療效分析[D];浙江大學(xué);2008年

4 白家駟;惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞體外三維成型特性和諾帝抑制作用的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

5 陳澤;IGFBP-3與惡性膠質(zhì)瘤的相關(guān)性分析[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

6 孫曉謙;rAd-p53聯(lián)合規(guī)范化治療惡性膠質(zhì)瘤的療效觀察[D];大連醫(yī)科大學(xué);2013年

7 梁鴻;下調(diào)EIF3B的表達(dá)抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

8 潘俊;顱內(nèi)惡性膠質(zhì)瘤術(shù)后替莫唑胺單純化療/聯(lián)合放療的療效觀察[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2008年

9 董雪濤;膠質(zhì)瘤中hMena蛋白表達(dá)與惡性膠質(zhì)瘤侵襲方式的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

10 楊德標(biāo);~(131)I攜帶CD133抗體靶向放療治療惡性膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2013年

，

本文編號(hào)：1656526