本文選題：DDX1　切入點：神經(jīng)母細(xì)胞瘤　出處：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童期較為難治的惡性實體腫瘤之一,遠(yuǎn)期療效較差。因此,開展兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤的相關(guān)基礎(chǔ)研究,具有重要意義。既往研究已充分顯示,MYCN基因突變與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn),DDX1(Dead box 1)基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中與MYCN基因共同擴(kuò)增,提示DDX1基因表達(dá)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生與發(fā)展中可能具有重要意義。本研究通過驗證DDX1基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤高表達(dá)的基礎(chǔ)上,探索和闡明了DDX1基因與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為和化療耐藥等方面的相關(guān)性。為深入研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)病機(jī)制和DDX1基因相關(guān)研究提供實驗依據(jù),以探索DDX1基因表達(dá)可能作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤臨床診治預(yù)后分析因素或治療靶點的潛在價值。第一部分:DDX1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)目的:探討神經(jīng)母細(xì)胞瘤臨床標(biāo)本中瘤組織及瘤旁組織中DDX1(Dead box 1)基因的表達(dá),驗證DDX1基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中高表達(dá),為本課題研究提供理論與實驗依據(jù)。方法:1.神經(jīng)母細(xì)胞瘤DDX1表達(dá):取5例初診兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤的瘤組織及瘤旁組織(至少距離瘤組織2 cm以上的非瘤組織),固定于4%的甲醛溶液中。將以上樣品石蠟包埋和切片后,采用DDX1抗體行免疫組化實驗,觀察瘤組織及瘤旁組織中DDX1的表達(dá)。2.免疫組化法半定量DDX1評分標(biāo)準(zhǔn):A.染色程度評分:不著色(0分);淺著色(1分);著色明顯(2分);深著色(3分)。B.陽性細(xì)胞比例:陽性細(xì)胞:10%(0分);10%~30%(1分);31%~60%(2分);≥61%(3分)。3.最終評分計算:(1)評分計算公式:(A+B)/2。(2)半定量換算:評分0~1分計為“-”;1.1~2.0分計為“+”;2.1~3.0分計為“++”;3.1~5.0計為“+++”。結(jié)果:經(jīng)免疫組化檢測5例標(biāo)本,每例的檢測結(jié)果均顯示,腫瘤組織的DDX1表達(dá)染色評分和陽性細(xì)胞百分率均明顯高于瘤旁組織。瘤組織中DDX1表達(dá)最終評分均值為1.8分,均為陽性;而瘤旁組織DDX1表達(dá)評分均值為0.5分,定量換算均為“-”,提示神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織的DDX1表達(dá)明顯高于瘤旁非腫瘤組織。結(jié)論:結(jié)果顯示,神經(jīng)母細(xì)胞瘤的腫瘤組織確實存在DDX1高表達(dá),為本課題開展DDX1基因與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的相關(guān)性研究,提供充分的理論與實驗依據(jù)。第二部分:靶向DDX1基因敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建目的:建立DDX1基因敲減的SK-N-BE(2)細(xì)胞系,為后續(xù)開展DDX1基因表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤生物學(xué)行為相關(guān)性研究,提供有效實驗條件。方法:1.設(shè)計sh靶點,構(gòu)建p Lenti6.3-EGFP-sh DDX1干擾慢病毒載體,并使用293T細(xì)胞包裝慢病毒。2.將包裝好的病毒感染SK-N-BE(2)細(xì)胞,感染成功的細(xì)胞會穩(wěn)定表達(dá)GFP綠色熒光。3.使用q PCR及Western blot技術(shù)檢測各個靶點的敲減效率,并選擇效率最高的靶點進(jìn)行后續(xù)實驗。結(jié)果:經(jīng)q PCR及Western blot實驗均顯示,2號靶點的敲減效率最高(60%),成功建立DDX1敲減的SK-N-BE(2)細(xì)胞系。結(jié)論:使用慢病毒感染的方法,可以成功得到DDX1敲減的SK-N-BE(2)穩(wěn)定細(xì)胞株。為本課題開展DDX1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為影響相關(guān)研究,提供有效實驗條件。第三部分:DDX1對SK-N-BE(2)細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響目的:觀察SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/sh V和SK-N-BE(2)/sh DDX1的細(xì)胞周期、增殖能力和細(xì)胞凋亡等方面的差異,揭示DDX1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞活力影響。方法:1.CCK-8法觀察細(xì)胞增殖能力:將生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/sh V和SK-N-BE(2)/sh DDX1細(xì)胞接種于96孔板,每孔接種數(shù)目為2000個細(xì)胞,并設(shè)5個副孔。使用CCK-8試劑盒分別檢測12 h、24 h、36 h、48 h 3組細(xì)胞的細(xì)胞數(shù),并取平均值,以時間(h)為橫坐標(biāo),450 nm處的OD讀數(shù)為縱坐標(biāo),繪制3種細(xì)胞的增殖曲線,觀察DDX1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力的影響。2.流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡:將生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/sh V和SK-N-BE(2)/sh DDX1細(xì)胞接種于6孔板,每孔接種數(shù)目為3×105個細(xì)胞/孔,培養(yǎng)24 h后使用流式細(xì)胞儀PI染色檢測SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/sh V和SK-N-BE(2)/sh DDX1細(xì)胞的凋亡差異,觀察DDX1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響。3.流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期:將生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/sh V和SK-N-BE(2)/sh DDX1細(xì)胞接種于6孔板,每孔接種數(shù)目為3×105個細(xì)胞/孔,培養(yǎng)24 h后使用流式細(xì)胞儀PI染色檢測SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE/sh V和SK-N-BE(2)/sh DDX1細(xì)胞各自位于G1、S、M、G2期的細(xì)胞比例,觀察DDX1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期的影響。結(jié)果:1.SK-N-BE(2)/shDDX1細(xì)胞增殖能力明顯弱于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/sh V細(xì)胞,提示DDX1敲減后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力減弱。2.SK-N-BE(2)/shDDX1細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯多于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/sh V細(xì)胞,提示DDX1敲減后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡增加。3.相對于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/sh V細(xì)胞,SK-N-BE(2)/sh DDX1細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯,細(xì)胞增殖能力下降。結(jié)論:抑制DDX1表達(dá),可導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞周期受阻,增殖能力減弱,細(xì)胞凋亡增加。提示,DDX1表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。第四部分:DDX1對SK-N-BE(2)細(xì)胞侵襲、遷移及耐藥能力的影響目的:探討DDX1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲、遷移及耐藥能力的影響。方法:1.目的病毒及陰性對照慢病毒感染目的細(xì)胞:將細(xì)胞懸液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(3×105個細(xì)胞/孔),5%CO2 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。2.Transwell檢測細(xì)胞遷移:用胰酶消化細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108個/L;加入0.1 m L細(xì)胞懸液于小室中,同時在下層孔板中加0.6 m L完全培養(yǎng)基;用鑷子將小室放到加有培養(yǎng)基的孔板中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng);每天觀察遷移情況,48 h時停止培養(yǎng);取出小室,去除小室中的上清,用棉簽擦掉小室上層的細(xì)胞;吸取0.5 m L 4%多聚甲醛置于另一個干凈的孔中,放入小室,室溫固定15 min。3.結(jié)晶紫染色觀察細(xì)胞遷移率:吸取1 mL洗滌液(Regent A)置于另一孔中,潤洗小室。吸取1 m L染色液(Regent B)置于另一個孔中,放入小室進(jìn)行染色,室溫放置20 min。取1 m L Regent A置于步驟1的洗滌孔中,將小室放回洗滌孔中洗滌,直到Regent A無色時,顯微鏡下拍照。每個小室選取5個視野計數(shù),計算細(xì)胞的侵襲率。在干凈的孔中加入600μL的裂解液(Regent C),放入小室,37℃孵育20 min,直至呈藍(lán)紫色澄清溶液,去掉小室,吸取100μL孔板中的溶液至于另一個清潔的孔板中。酶標(biāo)儀檢測570 nm處的OD值,計算細(xì)胞遷移率。4.細(xì)胞耐藥對比觀察:將生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期SK-N-BE(2)/Blank、SK-N-BE(2)/sh V和SK-N-BE(2)/sh DDX1細(xì)胞接種于96孔板,每孔接種數(shù)目為6000個細(xì)胞,并設(shè)5個副孔。將藥物加入細(xì)胞培養(yǎng)板,使阿霉素終濃度為1.0μg/m L,順鉑終濃度為2.5μg/m L。藥物處理24 h后使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果:1.SK-N-BE(2)/sh DDX1細(xì)胞侵襲能力明顯弱于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/sh V細(xì)胞。提示敲減DDX1,能使神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞侵襲能力下降。2.SK-N-BE(2)/sh DDX1細(xì)胞遷移能力明顯弱于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/sh V細(xì)胞。提示敲減DDX1,能使神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞遷移能力減弱。3.使用阿霉素和順鉑處理后,SK-N-BE(2)/sh DDX1的活細(xì)胞數(shù)明顯低于SK-N-BE(2)/Blank和SK-N-BE(2)/sh V細(xì)胞。提示敲減DDX1,能夠提高神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對阿霉素和順鉑等化療藥物的敏感性。結(jié)論:抑制DDX1表達(dá),可降低神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞侵襲和遷移能力,并提高對于阿霉素和順鉑等惡性實體腫瘤主要化療藥物的敏感性。全文歸納:1.課題研究依據(jù):兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤的年發(fā)病率僅為0.3/10萬~0.5/10萬,但本課題仍在研究前期積累到5例初診兒童病例,檢測驗證神經(jīng)母細(xì)胞瘤確實存在DDX1高表達(dá),使本研究獲得盡可能充分的理論與實驗依據(jù)。2.實驗條件制備:成功建立DDX1基因敲減的SK-N-BE(2)細(xì)胞系,為本課題開展DDX1基因?qū)ι窠?jīng)母細(xì)胞瘤功能的影響研究,提供有效實驗條件。3.研究結(jié)果歸納:通過細(xì)胞株對比研究發(fā)現(xiàn),敲減DDX1,能使神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖受阻、增殖能力下降、腫瘤細(xì)胞的侵襲或遷移能力減弱,并可導(dǎo)致對阿霉素和順鉑等化療藥物的敏感性增加。均提示DDX1基因表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展,以及臨床預(yù)后等因素密切相關(guān)。為深入開展DDX1基因相關(guān)研究提供實驗依據(jù),以探索DDX1基因表達(dá)可能作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤臨床診治預(yù)后分析因素或治療靶點的潛在價值。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 Derya Gumurdulu;Seyda Erdogan;Fazilet Kayaselcuk;Gulsah Seydaoglu;Cem K Parsak;Orhan Demircan;Ilhan Tuncer;;Expression of COX-2, PCNA, Ki-67 and p53 in gastrointestinal stromal tumors and its relationship with histopathological parameters[J];World Journal of Gastroenterology;2007年03期

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本文編號：1631888