本文選題：替莫唑胺　切入點(diǎn)：膠質(zhì)瘤　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：一、目的： 細(xì)胞老化(Cellular Senescence)是一種與衰老發(fā)生、腫瘤生成與進(jìn)展、壓力應(yīng)激、損傷修復(fù)等多種人體生理病理過程廣泛相關(guān)的細(xì)胞程序。近年來的研究表明,在腫瘤化學(xué)治療中,腫瘤細(xì)胞常常維持正常的生理活動(dòng)及代謝,停止分裂增殖,表現(xiàn)出細(xì)胞老化的表型以應(yīng)對(duì)化學(xué)藥物的作用。經(jīng)過細(xì)胞毒藥物處理的老化腫瘤細(xì)胞以長期的細(xì)胞分裂周期暫停,較低的增殖能力和侵襲能力為特征,可以被衰老相關(guān)的半乳糖苷酶染色所標(biāo)記。盡管誘導(dǎo)細(xì)胞老化的藥物作用機(jī)制各不相同,細(xì)胞老化廣泛在各種不同細(xì)胞背景的藥物治療中都有所發(fā)現(xiàn)。替莫唑胺作為惡性膠質(zhì)瘤一線化療藥物,也在近年來的研究中也顯示了非常典型的細(xì)胞老化誘導(dǎo)作用。作為烷化劑類藥物,替莫唑胺對(duì)DNA加甲基化產(chǎn)生包括O6-MeG等損傷位點(diǎn),這些DNA損傷可以雙向誘導(dǎo)凋亡或者是細(xì)胞老化。然而具體的介導(dǎo)細(xì)胞不同反應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制卻尚未明了。 細(xì)胞老化與凋亡同樣是替莫唑胺臨床療效在細(xì)胞水平上的具體表現(xiàn)。老化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞阻斷了腫瘤的快速生長及侵襲和血管生成能力。特別考慮到替莫唑胺所能誘導(dǎo)的凋亡作用實(shí)際上相當(dāng)有限,細(xì)胞老化對(duì)于替莫唑胺臨床療效的作用就更為重要了。但是,不同與凋亡徹底殺滅腫瘤細(xì)胞,老化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞仍然保持了一定的活力,同時(shí)細(xì)胞分裂增殖的停滯也阻斷了替莫唑胺作為基因毒藥物通過DNA的分裂復(fù)制擴(kuò)大DNA損傷的作用。對(duì)于老化細(xì)胞長期命運(yùn)的研究表明,細(xì)胞老化也并不是永久的細(xì)胞生長停滯,細(xì)胞有可能在一定的時(shí)間內(nèi)通過老化逃脫(Senescence escape)擺脫老化狀態(tài),重新增殖,從而使腫瘤復(fù)發(fā)。 基于對(duì)細(xì)胞老化可逆性(Reversibility of senescence)的考量,如果能減少替莫唑胺誘導(dǎo)的細(xì)胞老化促使膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡,或者阻斷老化細(xì)胞的逃脫,那么替莫唑胺的療效將可能進(jìn)一步提升。雖然有關(guān)細(xì)胞老化發(fā)生和維持的確切機(jī)制尚未能完全明了,既往的研究顯示增殖和凋亡的相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路可能參與到細(xì)胞老化的調(diào)控中。這本質(zhì)上也是協(xié)調(diào)各種細(xì)胞進(jìn)程,避免相互矛盾的信號(hào)指令的需要。舉例來說,當(dāng)細(xì)胞決定進(jìn)入老化狀態(tài)的時(shí)候,凋亡和增殖的相關(guān)作用就會(huì)被抑制。Bcl-2作為抗凋亡基因就能夠抑制細(xì)胞凋亡并且誘導(dǎo)細(xì)胞老化。本文著重對(duì)另一種抗凋亡蛋白,survivin的相關(guān)作用做進(jìn)一步探討。survivin是一種多功能的IAP家族蛋白,主要在胚胎及腫瘤組織中表達(dá),介導(dǎo)細(xì)胞凋亡抵抗及細(xì)胞周期進(jìn)程的推動(dòng)。早期的研究表明survivin可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受化療藥物誘導(dǎo)的凋亡作用及促進(jìn)細(xì)胞增殖。基于以上證據(jù),我們認(rèn)為survivin有可能在膠質(zhì)瘤替莫唑胺治療中促進(jìn)凋亡抵抗及老化細(xì)胞重新增殖。為此,本文采用干擾RNA抑制survivin在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)并探索其在替莫唑胺誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及老化中的效應(yīng)。 二、方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng) U251和U87細(xì)胞調(diào)合適濃度接種于6孔板或96孔板,加入含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于37℃,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞生長至良好狀態(tài)和濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 2.替莫唑胺干預(yù)細(xì)胞 細(xì)胞生長至合適的濃度和狀態(tài),根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?用不同濃度的替莫唑胺干預(yù)U251、U87細(xì)胞24小時(shí),進(jìn)行相關(guān)檢測,選取合適的劑量用于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 3.MTT檢測細(xì)胞活力 按照1×104/孔的濃度將細(xì)胞接種于九十六孔板,按實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)的處理因素,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。處理終止后,用移液器吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基,每孔加入D-hanks溶液輕輕洗3次,每次洗3min,然后每孔加入MTT溶液(濃度為5g/L,現(xiàn)用現(xiàn)配)20gL,再每孔補(bǔ)加100μL無血清的DMEM培養(yǎng)液,于5%C0237℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。4h后,終止培養(yǎng),慢慢吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基。然后每孔加入150μL的DMSO,室溫震蕩10min使藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚充分溶解,在酶標(biāo)儀490nm處測其OD值并計(jì)算各組細(xì)胞存活率。 4.β-半乳糖苷酶染色觀察細(xì)胞老化 吸除6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS輕柔洗滌1次,加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液,室溫下固定15分鐘。吸除細(xì)胞固定液,用PBS洗滌細(xì)胞3次,每次3分鐘。吸除PBS,每孔加入1毫升染色工作液(見染色工作液的配制)。37℃孵育過夜,可以用parafilm或保鮮膜封住6孔板防止蒸發(fā)。注意37℃孵育不能在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行。孵育完成后吸除工作液,加入2毫升PBS,普通光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。 染色工作液的配制：p-半乳糖苷酶染色液A10μl±p-半乳糖苷酶染色液B10μl-半乳糖苷酶染色液C930μl+X-Gal溶液50μl,使用聚丙烯(polypropylene)容器,不能使用聚苯乙烯(polystyrene)容器配制。 5.流式細(xì)胞儀檢測 細(xì)胞調(diào)整合適2×105/孔的濃度接種至六孔板,按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理后,用PBS洗滌細(xì)胞一次后離心(2000rpm,5min)收集并使用用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇固定單細(xì)胞懸液,4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ旧坝肞BS洗去固定液；加100pL RNase A37℃水浴30min避免RNA干擾；每份樣本中加入400μL PI染色混勻,4℃避光30min后上機(jī)檢測,記錄激發(fā)波長為488nm處紅色熒光。在細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)中,活細(xì)胞按說明書使用Ruby染色(Invitrogen)上機(jī)檢測DNA含量,達(dá)到預(yù)設(shè)DNA含量標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞被篩選后離心收集(2000rpm,5min),并接種全血清培養(yǎng)皿進(jìn)一步進(jìn)行集落生成實(shí)驗(yàn)。 細(xì)胞調(diào)整至合適2×105/孔的濃度接種至六孔板,按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理后,細(xì)胞用不含EDTA的胰酶短暫消化后收集,然后用PBS洗滌重懸細(xì)胞2次(2000rpm離心5min)；加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞,再加入5μLAnnexin V-FITC于細(xì)胞懸液中,用移液器輕輕混勻,最后加入5μL Propidium Iodide;將樣本處于室溫、避光處反應(yīng)5～15min,再進(jìn)行流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長530nm)。PI紅色熒光通過PI通道；Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測。使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞作為對(duì)照,進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。分別計(jì)算凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞占總細(xì)胞的比率,每組實(shí)驗(yàn)樣本重復(fù)三次以上。 7. Western blot檢測細(xì)胞蛋白表達(dá) 細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組處理完成后,以Western及IP細(xì)胞裂解液提取腫瘤細(xì)胞蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白定量,進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。以Actin為內(nèi)參,將處理好的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離,電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉后,孵育一抗和二抗,ECL顯色,KODAK Image Station2000MM成像系統(tǒng)采集圖像,獲得圖像用圖像處理軟件Image Tool3.0測定并分析條帶灰度值以檢測目的蛋白的表達(dá)水平。 8. SiRNA干擾 調(diào)合適的細(xì)胞濃度分別接種于六孔板或二十四孔板中,取狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)提供,打開離心管前先離心,然后再慢慢打開管蓋,溶解時(shí)加適量DEPC水后蓋上管蓋,振蕩溶解,使用150ul附送的DEPC水重懸1OD的siRNA,溶解后為20uM的樣品。使用GIBCO提供的lip2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天,在不包含抗生素的適量的培養(yǎng)基中接種細(xì)胞,轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度要達(dá)到30-50%。將寡聚物-LipofectamineTM2000復(fù)合物加入到每一個(gè)包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中。通過輕輕地前后搖動(dòng)培養(yǎng)板混合。37℃,C02培養(yǎng)箱孵育24-96小時(shí),直到適合進(jìn)行基因阻斷分析。 9.細(xì)胞集落生成實(shí)驗(yàn) 對(duì)指數(shù)生長期細(xì)胞,采用常規(guī)消化傳代方法,制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液反復(fù)吹打,使細(xì)胞充分分散,單個(gè)細(xì)胞百分率應(yīng)在95%以上。細(xì)胞記數(shù),并用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度,待用。根據(jù)細(xì)胞增殖能力,將細(xì)胞懸液倍比稀釋。一般按照10%的培養(yǎng)密度接種5ml細(xì)胞懸液到培養(yǎng)皿(直徑60mm)中,以十字方向輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿,使細(xì)胞分散均勻。培養(yǎng)皿置37℃、5%C02中培養(yǎng)2-3周,中間根據(jù)培養(yǎng)液pH變化適時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí),終止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)液,PBS液小心浸洗2次,空氣干燥。甲醇固定15分鐘,棄甲醇后空氣干燥。用Giemsa染液染色10分鐘,流水緩慢洗去染液,空氣干燥。 10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)屬于完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的計(jì)量資料,故采用單因素方差分析one—way ANOVA進(jìn)行方差分析,方差齊時(shí)采用LSD法進(jìn)行組間多重比較,方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法進(jìn)行組間多重比較,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。P0.05為有顯著性差異。 三、結(jié)果： 1. survivin干擾增加U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性 替莫唑胺具有雙向誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞老化的作用,在100μM左右的臨床相關(guān)劑量單次處理U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以在一周內(nèi)觀察到明顯的細(xì)胞凋亡及老化的反應(yīng)。為了研究survivin在替莫唑胺誘導(dǎo)的細(xì)胞老化及凋亡中的作用,我們采用小干擾RNA對(duì)U251細(xì)胞中的survivin進(jìn)行干擾,以隨機(jī)對(duì)照序列作為參照。由免疫印跡法檢測U251中的survivin的表達(dá),替莫唑胺處理后的U251細(xì)胞中的survivin處于穩(wěn)定表達(dá)的狀態(tài),經(jīng)干擾survivin的SiRNA處理的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞survivin表達(dá)被明顯抑制,而對(duì)照組無變化。 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對(duì)照經(jīng)過替莫唑胺處理后的生長曲線表明survivin干擾增加U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞相較對(duì)照早期出現(xiàn)明顯的細(xì)胞數(shù)目下降,并在一周左右的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞生長停滯,將細(xì)胞數(shù)目穩(wěn)定在一個(gè)相對(duì)較低的水平內(nèi)。進(jìn)一步的流式細(xì)胞分析凋亡細(xì)胞比例及周期分布顯示實(shí)驗(yàn)組早期細(xì)胞數(shù)目的下降是由于凋亡細(xì)胞比例的增加,而細(xì)胞生長停滯的原因則是因?yàn)橹蟪霈F(xiàn)G2/M分裂間期細(xì)胞數(shù)目和半乳糖苷酶染色陽性的老化細(xì)胞數(shù)目的上升。以上結(jié)果提示,survivin促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的化療抵抗,沉默survivin的表達(dá)使U251對(duì)替莫唑胺的反應(yīng)由細(xì)胞老化轉(zhuǎn)向凋亡。 2.替莫唑胺誘導(dǎo)的老化U251細(xì)胞長期培養(yǎng)后的再增殖和老化逃脫 細(xì)胞老化以往被定義為一種不可逆的細(xì)胞進(jìn)程,即細(xì)胞無法再獲得增殖能力。近年來的研究表明,對(duì)于失去自我增殖調(diào)控、快速增殖的腫瘤細(xì)胞,可以在老化后長時(shí)間培養(yǎng)中再次獲得自我更新(self-renewal)的能力。為此,我們使用Ruby染色流式分選TMZ處理后的老化細(xì)胞,并從這些老化細(xì)胞的長期培養(yǎng)中建立了兩個(gè)可以穩(wěn)定增殖的老化逃脫(senescence escape)細(xì)胞亞克隆,SE3-U251及SE5-U251,用以研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞老化逃脫的現(xiàn)象。 使用免疫印跡法檢測SE3-U251及SE5-U251的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)明顯的survivin表達(dá)上升,相較其老化的父輩細(xì)胞,這兩只老化逃脫的細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的治療也顯得更為抵抗,流式細(xì)胞檢測凋亡比例發(fā)現(xiàn)替莫唑胺誘導(dǎo)的凋亡在SE3-U251及SE5-U251細(xì)胞明顯下降。本章研究說明替莫唑胺誘導(dǎo)的老化膠質(zhì)瘤細(xì)胞可通過長期培養(yǎng)自行獲得再次增殖的能力,其衍生的老化逃亡高表達(dá)survivin并開始對(duì)替莫唑胺誘導(dǎo)的凋亡抵抗,提示survivin在細(xì)胞老化逃脫過程中有重要作用。 3.Survivin促進(jìn)U251細(xì)胞老化逃脫。 為了進(jìn)一步闡述survivin在U251細(xì)胞老化逃脫的作用,我們將針對(duì)survivin的小干擾RNA轉(zhuǎn)染至替莫唑胺誘導(dǎo)的已經(jīng)老化的U251細(xì)胞之中,并集落生成實(shí)驗(yàn)分別檢測細(xì)胞凋亡及增殖潛力。結(jié)果顯示：但顯著抑制了細(xì)胞集落的生成,周期檢測進(jìn)一步說明survivin的表達(dá)能夠使部分細(xì)胞恢復(fù)S期的分布。以上實(shí)驗(yàn)說明了survivin在膠質(zhì)瘤細(xì)胞老化逃脫的促進(jìn)作用。 4.抑制U87細(xì)胞的survivin表達(dá)促進(jìn)替莫唑胺誘導(dǎo)的p53依賴的凋亡發(fā)生。 p53是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外界壓力反應(yīng)的重要抑癌蛋白,能夠阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程及誘導(dǎo)凋亡。在發(fā)病年齡較大的膠質(zhì)瘤患者及原發(fā)性膠質(zhì)瘤病例中,有很大一部分腫瘤組織表達(dá)完整的野生型p53。大體上p53承擔(dān)與survivin大致相反的細(xì)胞功能。之前的研究還顯示,激活p53能夠直接結(jié)合survivin啟動(dòng)子對(duì)其進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)。這說明腫瘤細(xì)胞的p53蛋白表型有可能決定自身survivin能否表達(dá)以致發(fā)揮作用,也將影響survivin靶向干預(yù)的效果。為了能進(jìn)一步揭示survivin與p53潛在相互作用,以及兩者與替莫唑胺誘導(dǎo)的凋亡間的關(guān)系。我們選擇表達(dá)野生型p53的U87細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。 免疫印跡法檢測U87蛋白表達(dá)顯示替莫唑胺能夠充分誘導(dǎo)p53蛋白表達(dá)與激活(p21蛋白的轉(zhuǎn)錄激活),但使用干擾RNA抑制U87細(xì)胞的p53及survivin表達(dá)顯示兩者間并無直接的調(diào)控關(guān)系。與上文結(jié)果一致,抑制survivin表達(dá)增加U87對(duì)替莫唑胺的敏感性及凋亡反應(yīng),而混合轉(zhuǎn)染p53及survivin干擾RNA的細(xì)胞則能部分免于替莫唑胺的凋亡誘導(dǎo)。綜合上述結(jié)果說明,抑制survivin導(dǎo)致的凋亡增加依賴于p53的表達(dá),顯示在U87細(xì)胞中,survivin可以拮抗由替莫唑胺激活的p53誘導(dǎo)凋亡的作用。 四、結(jié)論： 1.細(xì)胞老化而非凋亡是替莫唑胺作用膠質(zhì)瘤細(xì)胞最主要的反應(yīng)。 2. survivin干擾增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性,主要表現(xiàn)為早期發(fā)生凋亡反應(yīng)及老化細(xì)胞的生成減少。 3.老化膠質(zhì)瘤細(xì)胞長期培養(yǎng)后可以逃脫增殖停滯并重新擴(kuò)增,老化逃脫的細(xì)胞對(duì)替莫唑胺誘導(dǎo)的凋亡進(jìn)一步抵抗。 4. Survivin促進(jìn)U251細(xì)胞老化逃脫。 5.抑制U87細(xì)胞的survivin表達(dá)促進(jìn)替莫唑胺誘導(dǎo)的p53依賴的凋亡發(fā)生
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.41
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本文編號(hào)：1625349