發(fā)布時間：2018-03-17 12:04

  本文選題：肌萎縮側(cè)索硬化　切入點：利美尼定　出處：《河北醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的： 肌萎縮側(cè)索硬化癥（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種選擇性累及上下運動神經(jīng)元為特點的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，一般在成年起病，多在起病后的3到5年因致命性呼吸衰竭死亡，目前尚無有效的治愈方法。ALS確切的致病機制迄今未明，目前研究的熱點是SOD1基因和TDP-43基因突變，這兩個基因的突變可以使細胞內(nèi)蛋白異常折疊和聚集，產(chǎn)生運動神經(jīng)元變性，從而導致ALS的發(fā)生和發(fā)展。細胞內(nèi)異常形成和聚集的蛋白主要通過自噬途徑被降解。 為了尋找能應(yīng)用于臨床的安全自噬誘導劑，Claudia Rose等人篩查了美國食品藥品監(jiān)督局（FDA）批準上市的藥品中發(fā)現(xiàn)利美尼定（rilmenidine），主要作用于中樞的降壓藥，可樂定的類似物，它在亨廷頓病鼠模型中能夠上調(diào)自噬，減少突變的亨廷頓蛋白的水平。此外，利美尼定還能減輕亨廷頓病鼠模型的疾病癥狀。亨廷頓病（Huntington’sdisease，HD)是由于突變的亨廷頓蛋白在胞內(nèi)異常聚集從而引起神經(jīng)元變性死亡。因此我們?yōu)榱俗C實利美尼定是否能夠誘導自噬，降解NSC34細胞內(nèi)與ALS相關(guān)的異常的毒性蛋白。我們在NSC34細胞系中應(yīng)用利美尼定，通過蛋白免疫印跡（western blotting）的方法來檢測LC3-Ⅱ水平，首先來驗證利美尼定是否有誘導自噬的作用。再將WT SOD1、G93ASOD1、WT TDP-43、TDP-25、TDP-35質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NSC34細胞系構(gòu)建ALS細胞模型，通過蛋白免疫印跡的方法對比用藥組和空白組中外源性蛋白的表達水平。最后應(yīng)用特異性自噬抑制劑3-MA（3-methyl adenine，3-MA）證明利美尼定是通過自噬途徑降解細胞內(nèi)異常聚集的蛋白。綜上，我們的數(shù)據(jù)表明利美尼定可以在ALS細胞模型中通過自噬途徑清除細胞中異常的毒性蛋白，可能達到對神經(jīng)元的保護作用。這就為以后探索利美尼定在ALS等變性疾病動物模型中保護性機制，甚至為后續(xù)變性病的臨床試驗研究提供了一定的實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。 方法： 1細胞培養(yǎng)及SOD1、TDP-43轉(zhuǎn)染NSC34細胞系的建立 NSC34細胞系是具有很多運動神經(jīng)元特性的雜交細胞系，我們用10%滅活胎牛血清、青霉素及鏈霉素配制的高糖DMEM作為其培養(yǎng)液，使其在37℃、含有5%二氧化碳的溫箱中生長傳代。我們應(yīng)用lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑用瞬時轉(zhuǎn)染的方法將EGFP-WT SOD1、EGFP-G93A SOD1和EGFP-TDP-25、EGFP-TDP-35、MYC-WT TDP-43質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至NSC34細胞。轉(zhuǎn)染了EGFP-WT SOD1、EGFP-G93ASOD1、EGFP-TDP-25、EGFP-TDP-35、MYC-WT TDP-43質(zhì)粒的NSC34細胞在上述培養(yǎng)液中進行生長傳代。 2治療藥物與干預方案 將NSC34細胞分為給藥干預組和對照組，將利美尼定儲備液配制成1um、5um、10um、20um不同濃度的工作液分別對NSC34細胞進行干預，利用western blotting的方法檢測NSC34細胞中LC3及P62的蛋白質(zhì)表達水平，來探索利美尼定上調(diào)自噬的最佳作用濃度。把過表達EGFP-WTSOD1、EGFP-G93A SOD1、EGFP-TDP-25、EGFP-TDP-35、MYC-WTTDP-43的NSC34細胞分別分為給藥干預組和對照組，通過westernblotting的方法檢測細胞中過表達蛋白的表達水平，來觀察利美尼定是否有降解蛋白質(zhì)的作用。應(yīng)用自噬通路特異性阻斷劑3-MA干預過表達EGFP-TDP-25的NSC34細胞，用western blotting的方法檢測過表達蛋白的表達水平，來進一步驗證利美尼定是否通過自噬通路降解細胞內(nèi)異常聚集的蛋白。 3蛋白免疫印跡 收集細胞，提取總蛋白。應(yīng)用BCA蛋白濃度測定法測定蛋白的濃度，，每個蛋白樣本進行10%或12%的鈉十二烷基的硫酸鹽（SDS）聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳，凝膠上蛋白就轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。將這些包含有蛋白的PVDF膜與一抗在4℃下孵育過夜。第二天經(jīng)過洗膜后，再與結(jié)合有熒光染料的二抗孵育。最后用Odyssey紅外圖像掃描系統(tǒng)對PVDF膜進行掃描以確定某一蛋白的表達。 結(jié)果： 1利美尼定對NSC34細胞中內(nèi)源性蛋白LC3-Ⅱ及P62表達水平的影響。 通過應(yīng)用western blotting檢測NSC34細胞內(nèi)LC-Ⅱ及P62表達水平，結(jié)果顯示應(yīng)用1uM、5uM、10uM、20uM的利美尼定干預NSC34細胞后LC3-Ⅱ的表達水平均高于空白對照組，但在利美尼定濃度為10uM時最明顯，差別具有統(tǒng)計學意義（P㩳0.05），而P62在此條件下下降最明顯，差別具有統(tǒng)計學意義（P㩳0.05）。 2利美尼定對ALS疾病相關(guān)蛋白質(zhì)表達水平的影響。 我們應(yīng)用的質(zhì)粒帶有EGFP或MYC標簽，應(yīng)用抗EGFP抗體或抗MYC抗體檢測各類蛋白質(zhì)的變化。結(jié)果顯示利美尼定降低過表達EGFP-G93A SOD1、EGFP-TDP-25、EGFP-TDP-35的NSC34細胞中表達的外源性蛋白的水平，給藥干預組和空白對照組差別具有統(tǒng)計學意義（P㩳0.05），而對過表達MYC-WT TDP-43和EGFP-WT SOD1的NSC34細胞中表達的外源性蛋白的水平無影響，給藥干預組和空白對照組的差別無統(tǒng)計學意義（P0.05）。 3自噬通路的特異性阻斷劑3-MA對利美尼定降解蛋白質(zhì)作用的影響。 應(yīng)用抗EGFP抗體檢測過表達EGFP-TDP-25的NSC34細胞內(nèi)表達的外源性TDP-25蛋白，結(jié)果顯示應(yīng)用3-MA和利美尼定干預組中TDP-25蛋白的表達水平較單獨應(yīng)用利美尼定干預組顯著上升，差別具有統(tǒng)計學意義（P㩳0.05）。 結(jié)論： 1給予利美尼定干預后，NCS34細胞內(nèi)源性的自噬泡標志分子LC3-Ⅱ表達水平明顯升高，而介導被降解蛋白與LC3-Ⅱ相連接的自噬流的標記分子P62表達水平明顯下降，證實了利美尼定具有上調(diào)自噬的作用。 2因為已經(jīng)證實基因突變引起細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的異常聚集和折疊，從而對細胞產(chǎn)生毒性作用，可以導致ALS的發(fā)生。我們將與ALS致病相關(guān)的WT SOD1、G93A S0D1、TDP-25、TDP-35、WT TDP-43質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NSC34細胞內(nèi)，給予利美尼定干預后過表達G93AS0D1、TDP-25、TDP-35的NSC34細胞中外源性蛋白的表達水平較空白對照組明顯下降，而過表達的WTSOD1、WT TDP-43的NSC34細胞中外源性蛋白的表達水平較空白對照組無明顯差異。因此，我們得出利美尼定可以清除ALS細胞模型中與致病相關(guān)的毒性蛋白。利美尼定能夠促進G93AS0D1、TDP-25、TDP-35的降解，而對WT SOD1以及WT TDP-43沒有降解作用。 3因為細胞內(nèi)異常聚集的蛋白主要是通過兩個途徑清除：自噬-溶酶體途徑和泛素化-蛋白酶體途徑，為了證實利美尼定是通過自噬途徑清除細胞內(nèi)的毒性蛋白，我們在本實驗中加用特異性自噬通路抑制劑3-MA(3-methyl adenine,3-MA)，將3-MA和利美尼定同時作用于過表達TDP-25的NSC34細胞與利美尼定單獨作用于過表達TDP-25的NSC34細胞比較發(fā)現(xiàn)，3-MA減弱利美尼定降解蛋白質(zhì)的作用，即當自噬通路被抑制時利美尼定降解細胞內(nèi)毒性蛋白的作用下降。 4綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)利美尼定在ALS細胞模型中通過自噬途徑清除細胞內(nèi)的毒性蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮對細胞的保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R744.5

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本文編號：1624656