本文選題：磁共振擴(kuò)散張量成像　切入點(diǎn)：交叉性小腦神經(jīng)機(jī)能聯(lián)系不能　出處：《鄭州大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：缺血性腦梗死是威脅我國(guó)人類健康的常見(jiàn)疾病,是較為嚴(yán)重的缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)其中之一,其特點(diǎn)為高發(fā)病率、高死亡率以及高致殘率,部分預(yù)后不佳,一旦罹患,勢(shì)必會(huì)為社會(huì)及家庭、個(gè)人造成負(fù)擔(dān)。因此,越來(lái)越多的臨床學(xué)者聚焦于腦梗死的預(yù)后改善及神經(jīng)功能恢復(fù)的研究。隨著相關(guān)研究的增多,人們發(fā)現(xiàn),腦梗死后不僅原發(fā)病灶區(qū)域可出現(xiàn)相應(yīng)的病理生理學(xué)改變,其遠(yuǎn)隔部位如對(duì)側(cè)大腦半球和雙側(cè)小腦亦可出現(xiàn)繼發(fā)性的功能及代謝障礙,而這一現(xiàn)象可能在神經(jīng)功能恢復(fù)中起著重要作用,其發(fā)生機(jī)制與神經(jīng)機(jī)能聯(lián)系不能學(xué)說(shuō)有關(guān)。神經(jīng)機(jī)能聯(lián)系不能(diaschisis),這個(gè)名詞提出于上個(gè)世紀(jì)初,即局限于幕上的腦組織損傷可造成與它有纖維聯(lián)系的其他區(qū)域的功能改變。隨著人們對(duì)此現(xiàn)象了解的進(jìn)一步深入以及先進(jìn)檢查手段的運(yùn)用,對(duì)神經(jīng)機(jī)能聯(lián)系不能的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及對(duì)于其臨床意義的認(rèn)識(shí)都取得了極大的進(jìn)展,對(duì)臨床診斷及治療均起到一定的指導(dǎo)意義,在腦梗死患者的康復(fù)過(guò)程中亦起到了一定影響。擴(kuò)散張量成像(diffusion tensor imaging,DTI)是一種用于描述水分子擴(kuò)散方向特征的磁共振技術(shù),它可以通過(guò)計(jì)算水分子的彌散程度和彌散方向間接的評(píng)價(jià)大腦白質(zhì)纖維的完整性。DTI不只反映水分子擴(kuò)散受限的整體情況,還反映水分子擴(kuò)散受限的方向性,是目前唯一一種能有效觀察和追蹤腦白質(zhì)纖維束的非侵入性檢測(cè)方法。RGMa蛋白(Repulsive guidance molecule,A)在中樞神經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中起著重要作用,其介導(dǎo)排斥性軸突導(dǎo)向信號(hào)以及神經(jīng)管的閉合,參與神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化,參與了腦梗死后神經(jīng)元及軸突的修復(fù)與再生。本實(shí)驗(yàn)擬運(yùn)用RNAi技術(shù),構(gòu)建重組腺病毒為載體的r Ad5-sh RNA-RGMa,對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型缺血區(qū)域大腦皮質(zhì)、基底節(jié)區(qū)進(jìn)行基因沉默,觀察該特異性干預(yù)手段對(duì)急性局灶性缺血大鼠腦組織RGMa表達(dá)水平、軸突生長(zhǎng)/再生情況以及神經(jīng)功能恢復(fù)的影響,結(jié)合磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像檢查,進(jìn)一步闡明RGMa在中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生抑制因子中的重要地位,探討交叉性小腦神經(jīng)機(jī)能聯(lián)系不能(crossed cerebellar diaschisis,CCD)的發(fā)生機(jī)制,為臨床腦缺血及CCD的監(jiān)測(cè)評(píng)估和治療尋找有效靶點(diǎn),為腦缺血后促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)提供依據(jù)并奠定基礎(chǔ)。本文分為以下三個(gè)部分。第一部分RGMa在MCAO大鼠腦組織的表達(dá)及與軸突再生的關(guān)系目的觀察急性局灶性腦缺血損傷大鼠腦組織中RGMa表達(dá)水平、軸突生長(zhǎng)/再生情況以及對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的影響,結(jié)合磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像及相關(guān)參數(shù)的量化評(píng)價(jià),為CCD現(xiàn)象的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù),為下一步實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。方法建立大鼠MCAO模型,將模型組隨機(jī)分為12h、24h、48h、7d、10d組,與對(duì)照組一起分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)行MRI掃描,測(cè)量ADC值和FA值。掃描后取腦組織,RT-PCR方法檢測(cè)RGMa和Rho A m RNA的表達(dá)情況,免疫組化法檢測(cè)RGMa、Rho A蛋白、軸突再生情況,TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果模型組大鼠梗死側(cè)核心區(qū)及雙側(cè)小腦ADC值和FA值較正常組降低,12h降至最低,梗死對(duì)側(cè)小腦降低較同側(cè)小腦更為顯著(P0.05)。術(shù)后12h起可見(jiàn)RGMa陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)并持續(xù)增加,48h表達(dá)達(dá)高峰,雙側(cè)小腦半球RGMa蛋白表達(dá)較之對(duì)照組均顯著升高(P0.05),以右側(cè)小腦為著。RGMa蛋白表達(dá)與磁共振參數(shù)及軸突生長(zhǎng)情況呈顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)論與正常組相比,大鼠腦梗死后雙側(cè)小腦的影像學(xué)參數(shù)及病理學(xué)指標(biāo)的變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且右側(cè)較左側(cè)為著,說(shuō)明腦梗死后CCD現(xiàn)象存在。RGMa蛋白參與軸突的再生與重塑,間接說(shuō)明磁共振參數(shù)變化及與CCD現(xiàn)象的關(guān)聯(lián)機(jī)制,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。第二部分RGMa特異性RNAi重組腺病毒的構(gòu)建目的構(gòu)建靶向Rat RGMa基因sh RNA腺病毒載體以及完成病毒載體的包裝,為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。方法設(shè)計(jì)3條靶序列sh RNA進(jìn)行篩選,設(shè)計(jì)并合成編碼短發(fā)夾RNA(sh RNA)序列的DNA單鏈,退火鏈接,稀釋備用。構(gòu)建RGMa特異性RNAi腺病毒載體,酶切、測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞進(jìn)行最佳干擾片段的篩選。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)重組腺病毒r Ad5-sh RNA-RGMa轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后RGMa m RNA的轉(zhuǎn)錄抑制情況及重組腺病毒r Ad5-sh RNA-RGMa轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后的轉(zhuǎn)染效率,篩選出最佳干擾片段。結(jié)果設(shè)計(jì)的3條si RNA中,Adv-si R1的轉(zhuǎn)染效率最高,測(cè)定其滴度為2.5×109Pfu/ml,用于下部分實(shí)驗(yàn)。Adv(-)的測(cè)定滴度為2.1×109Pfu/ml,用于陰性對(duì)照。結(jié)論成功構(gòu)建靶向Rat RGMa基因的sh RNA腺病毒載體,轉(zhuǎn)染效果穩(wěn)定有效,可用于下部分實(shí)驗(yàn)。第三部分RGMa特異性RNAi轉(zhuǎn)染后MCAO大鼠RGMa表達(dá)及MR成像目的采取基因沉默技術(shù),特異性沉默MCAO大鼠腦皮質(zhì)及基底節(jié)RGMa蛋白的表達(dá),觀察其對(duì)缺血側(cè)腦組織及其遠(yuǎn)隔部位RGMa表達(dá)水平和軸突再生以及大鼠神經(jīng)功能的影響,為缺血性腦梗死及CCD的治療提供新的視角。方法建立大鼠MCAO模型,隨機(jī)分為模型2d組,空白對(duì)照2d組,陰性對(duì)照2d組,RNAi干預(yù)2d組,分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)行磁共振檢查,每組4只應(yīng)用western blotting方法檢測(cè)RGMa蛋白的表達(dá)情況,8只應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)RGMa蛋白及軸突再生情況。結(jié)果與模型組相比,干預(yù)組梗死核心區(qū)即左側(cè)基底節(jié)區(qū)ADC值及FA值有所升高,RGMa蛋白表達(dá)降低(P0.05),陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組與模型組相比無(wú)明顯變化。雙側(cè)小腦ADC值及FA值、RGMa蛋白表達(dá)4組無(wú)差異。結(jié)論給予RGMa特異性RNAi重組腺病毒Adv-sh RNA-RGMa行干預(yù)治療后,大鼠幕上腦組織RGMa表達(dá)降低,磁共振參數(shù)升高,說(shuō)明該方法對(duì)于腦梗死的治療有效,為臨床腦梗死的治療提供了新的靶點(diǎn)及無(wú)創(chuàng)性監(jiān)測(cè)手段。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1595119