本文選題：DMD　切入點：AAV9　出處：《河北醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:杜氏肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是肌營養(yǎng)不良性肌病中最嚴重的一種,是一種X連鎖隱形遺傳病,發(fā)病率最高,約為1/3500男嬰。主要為編碼dystrophin蛋白的基因發(fā)生突變,dystrophin蛋白生成缺陷,致使細胞膜結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,在外部機械力的作用下極易發(fā)生損傷,導致肌細胞壞死,伴隨炎癥細胞的浸潤吞噬壞死細胞過程,而肌肉本身的再生修復(fù)能力不足以彌補其壞死的程度,纖維結(jié)締組織和脂肪組織便隨后替代壞死的區(qū)域。DMD的病人肌肉損傷持續(xù)性進展,無力逐漸加重,通常于20歲左右死于呼吸、循環(huán)衰竭。對于此病,目前尚無有效的治療辦法。Mdx小鼠是研究DMD的一種經(jīng)典的模型鼠。此種小鼠表現(xiàn)為高CK血癥及和人類肌營養(yǎng)不良相似的肌肉病理情況。對于mdx小鼠的治療,有各種各樣的方法。目前,利用載體將正常的dystrophin基因?qū)肷矬w內(nèi)或修復(fù)其突變成為一大熱點,但dystrophin基因過于龐大,成為這一方法的一大阻礙。近年來,很多人將目光放在肌營養(yǎng)不良肌病的各種癥狀上,利用各種生長因子,通過不同的信號途徑促進肌細胞的再生,從而改善肌病的狀況。胰島素樣生長因子-1(Insulin like growth factor-1,IGF-1)已成為治療DMD的一個重要備選方向。IGF-1也被稱作"促生長因子"(即somatomedin C),是一種在分子結(jié)構(gòu)上與胰島素類似的多肽蛋白物質(zhì)。IGF-1在嬰兒的生長和在成人體內(nèi)持續(xù)進行合成代謝作用上具有重要意義。它是人體內(nèi)肝細胞、腎細胞、脾細胞等十幾種細胞自分泌和旁分泌的產(chǎn)物。具有降血糖、降血脂、舒張血管等作用,同時還是人體內(nèi)非常重要的細胞有絲分裂促進劑,其對維持與細胞分化有關(guān)的蛋白質(zhì)水平十分重要,與一些生長因子合用能促進細胞分化成熟。目前關(guān)于IGF-1對于mdx小鼠的研究,主要為兩方面:一是mdx/m IGF-1轉(zhuǎn)基因小鼠的觀察,另一個是IGF-1蛋白對mdx小鼠的作用的研究。兩種方法雖然均有效果,但第一種不適宜向臨床推廣,第二種在蛋白入血后有較多副作用,且需長期持續(xù)給藥,操作費時費力。在本實驗中,我們以腺相關(guān)病毒血清型9(Adeno-associated virus serotype 9,AAV9)為載體攜帶人胰島素樣生長因子-1(human insulin like growth factor-1,hIGF-1)hIGF-1基因,首先局部注射入脛前肌,觀察此種方法的具體作用,其次經(jīng)尾靜脈注射入小鼠全身,觀察是否可在全身的骨骼肌中發(fā)揮作用。方法:我們的實驗分為兩個階段:首先是局部注射的方法,將病毒直接注射入小鼠右側(cè)脛前肌,一定時間后觀察;其次是通過尾靜脈注射入病毒,一定時間后觀察。1通過局部注射的方法觀察以AAV9為載體攜帶hIGF-1基因是否對mdx小鼠肌肉產(chǎn)生作用選取4周齡、體重相近的雄性mdx小鼠8只,分為2組。4只于右側(cè)脛前肌注射AAV9攜帶的綠色熒光蛋白(Green Fluorescence Protein,GFP)基因(20μl/只1×10~(12) vg/m L),分2點注射,每點約注射10μl,4只于右側(cè)脛前肌注射AAV9-hIGF-1(20μl/只1×10~(12) vg/m L),同樣分2點注射,每點約注射10μl。另選取4只4周齡、體重相近的雄性C57BL/10小鼠作為對照。8周后(即小鼠12周齡時)將小鼠麻醉后在右側(cè)脛前肌進行肌力測試,隨后摘眼球取血,留取血清樣本測CK值,最后完整分離右側(cè)脛前肌稱重,并包埋,進行冰凍切片的處理,以及各種指標的檢測。2通過尾靜脈注射的方法觀察以AAV9為載體攜帶hIGF-1基因是否對mdx小鼠全身骨骼肌產(chǎn)生作用選取6周齡、體重相近的雄性mdx小鼠6只,分為2組。3只經(jīng)尾靜脈注射AAV9-GFP(200μl/只1×10~(12) vg/ml),3只經(jīng)尾靜脈注射AAV9-hIGF-1(20μl/只1×10~(12) vg/ml)。另選取3只4周齡、體重相近的雄性C57BL/10小鼠3只作為對照。6周后(即小鼠12周齡時)將9只小鼠麻醉后取材,進行同樣的評估。另同時分離兩側(cè)股四頭肌、腓腸肌、肱三頭肌,右側(cè)所有肌肉包埋,進行冰凍切片的處理,隨后進行各種指標的檢測。應(yīng)用spss13.0系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果:1局部脛前肌注射AAV9介導hIGF-1基因過表達改善了mdx小鼠的肌肉病理及肌肉功能1.1 mdx小鼠經(jīng)局部脛前肌注射AAV9-GFP后,觀察到其肌肉組織中有綠色熒光蛋白的表達。驗證了在本實驗室條件下AAV9可以成功的轉(zhuǎn)染肌細胞并表達所攜帶的基因;1.2免疫熒光結(jié)果表明與C57BL/10組、GFP組相比,只有hIGF-1組小鼠脛前肌中表達hIGF-1;1.3 hIGF-1組、GFP組、C57BL/10組右側(cè)脛前肌重量比較,hIGF-1組最大,為80.70±8.00mg,GFP組為58.35±4.26mg,C57BL/10組為39.93±0.81mg。各組之間差異均有統(tǒng)計學意義。因發(fā)現(xiàn)GFP組較C57BL/10組大,為驗證mdx小鼠同C57BL/10肌重的區(qū)別,我們又增加一組未給任何干預(yù)的mdx小鼠,測其肌重,為60.20±2.75mg,與GFP組相比差異無統(tǒng)計學意義。1.4 hIGF-1組、GFP組、C57BL/10組肌肉損傷程度定量比較1.4.1血清CK水平:野生型小鼠血清CK水平為5076.67±3959.18U/L,AAV9-GFP mdx小鼠CK值為26345.64±5762.39 U/L,AAV9-hIGF-1 mdx小鼠CK值為39446.28±15905.25 U/L。mdx小鼠較正常野生型小鼠CK值均升高,但GFP組和hIGF-1組之間無明顯差別;1.4.2肌肉病理:蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色中,GFP組小鼠脛前肌壞死面積較大,所占比例為6.33±2.51%,hIGF-1組小鼠脛前肌壞死面積相比GFP組有所減少,所占比例為2.14±0.43%,差異具有統(tǒng)計學意義;而兩組再生肌纖維數(shù)目占總纖維數(shù)的百分比無明顯差異;1.4.3肌力:hIGF-1組小鼠脛前肌的肌力最大,其次為GFP組,野生型小鼠肌力最小;而脛前肌的耐力測試,結(jié)果正好相反。2尾靜脈注射AAV9介導hIGF-1基因過表達改善了mdx小鼠的肌肉病理及肌肉功能2.1 mdx小鼠經(jīng)尾靜脈注射AAV9-GFP后,觀察到只有脛前肌表達較多量綠色熒光蛋白,其余肌肉表達量很少;2.2免疫熒光結(jié)果表明與C57BL/10組、GFP組相比,只有hIGF-1組小鼠脛前肌中表達hIGF-1,因小鼠本身并不產(chǎn)生此種蛋白;2.3 hIGF-1組、GFP組、C57BL/10組右側(cè)脛前肌重量比較,hIGF-1組最大,為75.03±4.54mg,GFP組為55.63±13.34mg,C57BL/10組為40.07±0.93mg。各組之間差異均有統(tǒng)計學意義。2.4 hIGF-1組、GFP組、C57BL/10組肌肉損傷程度定量比較2.4.1血清CK水平:AAV9-GFP mdx小鼠CK值為33418.57±11695.54U/L,AAV9-hIGF-1 mdx小鼠CK值為31855.8±16394.13 U/L。mdx小鼠較正常野生型小鼠CK值均升高,但GFP組和hIGF-1組之間無明顯差別;2.4.2肌肉病理:HE染色中,AAV9-GFP mdx小鼠脛前肌壞死面積所占比例為6.34±2.51%,AAV9-hIGF-1 mdx小鼠脛前肌壞死面積所占比例為2.46±0.54%,較之明顯減少;而中心核細胞所占比例,經(jīng)計數(shù),無統(tǒng)計學意義;2.4.3肌力:hIGF-1組小鼠脛前肌的肌力均大于對照組、GFP組;hIGF-1組小鼠脛前肌的耐力測試,小于C57BL/10組,大于GFP組。結(jié)論:1 AAV9攜帶的hIGF-1基因可在小鼠骨骼肌中成功表達;2 AAV9攜帶的hIGF-1基因在體內(nèi)表達在病理上可促進mdx小鼠骨骼肌細胞肥大、壞死程度減輕;3 AAV9攜帶的hIGF-1基因在體內(nèi)表達可促進mdx小鼠骨骼肌功能恢復(fù);4 AAV9攜帶的hIGF-1基因在mdx小鼠體內(nèi)發(fā)揮作用的具體機制,以及長期表達是否會產(chǎn)生副作用,仍需要我們進一步探索。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R746.2

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